СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ АНТИГЕНОВ И АНТИТЕЛ В СЫВОРОТКАХ КРОВИ Российский патент 2009 года по МПК G01N33/544 

Изобретение относится к области медицины, а именно к иммунологии, в частности может быть использовано для выявления различных антигенов и антител при диагностике инфекционных заболеваний, контроля уровня гуморального ответа и др.

Из практики медицины известны способы выявления антигенов и антител в сыворотках крови, основанные на использовании в качестве носителя сенситинов эритроцитов человека и животных (Конникова Р.Е., Носков Ф.С., Баяр Г.А. Разработка эритроцитарных препаратов для выявления антител и антигенов в РНГА // Реакция непрямой гемагглютинации. Ленинград, 1981. С.13-31). Недостатками известного способа выявления являются:

- способность эритроцитов к спонтанному лизису;

- возможность спонтанной агглютинации;

- ограниченный срок хранения крови, из которой получают эритроциты;

- необходимость выполнения консервации и фиксации эритроцитов;

- частичная утрата активности готовых препаратов. Все это не дает возможность получить конкретный технический результат - повышение точности и чувствительности способа.

Одним из распространенных способов иммунодиагностики является использование частиц полистиролового латекса в качестве носителя сенситинов (Фримель Г. // Иммунологические методы. - М.: Медицина, 1987, С.219-221).

Недостатками способа являются:

- не всякая партия латекса годится для создания диагностикума;

- латекс-диагностикум на HBsAg только у 30% больных с положительной реакцией выявляются гистологические изменения;

- ревматоидный фактор и продукты фибринолиза могут обуславливать возникновение ложноположительных результатов, что не дает возможность получить конкретный технический результат - повышение точности и чувствительности способа.

Наиболее близким к предлагаемому способу является реакция агломерации масляного антигена, т.к. в обеих реакциях носителями сенситинов являются жидкости. Сходство известного способа с предлагаемым состоит в том, что оба способа относятся к иммунологии. Сущность известного способа состоит в адсорбции бактериального антигена на мелкодисперсной масляной эмульсии, которая в дальнейшем способна вступать в специфическое взаимодействие с антителами иммунной сыворотки с образованием крупнодисперсной эмульсии. Используют подсолнечное или иные жидкие масла, в которые в качестве эмульгатора добавляют раствор буры или поливинилового спирта. Смесь встряхивают на шюттель-аппарате (Никитин В.М. // Справочник серологических реакций. Кишинев: Штиинца: 1977, С.138-139).

Реакция агломерации масляного антигена не получила широкого распространения. Недостатками способа являются:

- низкая чувствительность реакции масляного антигена, что свидетельствует о недостаточной точности способа;

- масляная эмульсия имеет малую сорбционную способность;

- ее полидисперсность;

- нестабильность масляной эмульсии.

Т.о., перечисленные недостатки не позволяют получить конкретный технический результат - повышение точности и чувствительности способа. Предлагаемое изобретение решает основную задачу - повышение точности и чувствительности способа. Сущность изобретения выражена совокупностью существенных признаков, достаточных для обеспечиваемого изобретением технического результата - эффективности выявления антигенов и антител в реакции агрегации капель эмульсии.

Решение задачи заключается в том, что в качестве носителя антител или антигенов применили субмикронную монодисперсную стабильную эмульсию перфторорганических соединений (ПФОС). Использовалась ПФОС, выпускаемая промышленностью в виде 10 об.% субмикронной эмульсии «Перфторан» (производство ОАО НПО «Перфторан»), предназначенная для лечения больных как кровезаменитель с газотранспортной функцией. Эмульсия состоит из смеси перфторорганических соединений (перфтордекалин и перфторметилциклогексилпиперидин) с добавлением в качестве эмульгатора поверхностно-активного вещества проксанола, а также натрия хлорида, магния хлорида, калия хлорида, натрия гидрокарбоната, натрия гидрофосфата и глюкозы. Капельки эмульсии имеют в диаметре около 0,1 мкм. Эмульсия стабильна, химически инертна. Ввиду малых размеров капель общая поверхность 1 мл эмульсии составляет около 60 м². Она обладает высокой способностью растворять кислород и углекислый газ. Большим недостатком эмульсии как кровезаменителя является способность капель сорбировать на своей поверхности белки, липиды и другие вещества. Этот недостаток и малые размеры капель использованы авторами для создания носителей антигенов и антител, которые применены в иммунологической реакции антиген/антитело.

Разработка предлагаемого способа проводилась на базе лабораторий Научно-исследовательского института краевой инфекционной патологии Астраханской государственной медицинской академии Росздрава и ФГУ «Научно-исследовательского института по изучению лепры Росздрава», г.Астрахань.

Субмикронную гомогенную 10 об.% эмульсию ПФОС 0,5 мл промывали 4-5 раз 6-кратным объемом глицинового буфера (рН 8,8) от солей и глюкозы, входящих в состав препарата, центрифугированием при 5000 об/мин ×7-10 мин.

Приготовление буфера: 46,7 мл 2М глицина (15 г на 100 мл воды) смешивали с 10 мл 1М NaOH (4 г на 100 мл Н₂О) и добавляли равный объем физиологического раствора.

Ниже приводятся результаты апробации.

Пример 1. Для выявления поверхностного антигена вируса гепатита В (HBsAg) к 1 мл подготовленной таким образом эмульсии ПФОС в указанном выше буфере вносили 100-150 мкг козьих антител, полученных из предприятия «ИмБио», г. Н.Новгород, с содержанием белка 1 мг/мл, титр в реакции преципитации по Оухтерлони 1:128.

Смесь инкубировали 2 часа при комнатной температуре при периодическом встряхивании содержимого пробирки, после чего производили тщательную промывку (6-7 раз) глициновым буфером (рН 8,8) объемом 5 мл до Е₂₈₀=0 с целью удаления свободного белка. Эмульсию ПФОС, несущую на своей поверхности антитела к HBsAg, использовали в рабочем разведении 1:5 для постановки реакции агрегации на стекле. Параллельно для оценки эффективности предлагаемого способа выявления HBsAg применяли метод иммуноферментного анализа (ИФА). Объектом исследования служили образцы сыворотки крови от больных острыми (ОГВ), хроническими гепатитами В (ХГВ) и носителей HBsAg, содержащие HBsAg по результатам тестирования с помощью наборов ИФА-HBs производства НПО «Диагностические системы», г.Н.Новгород, прилагаемые к ним заведомо положительный (содержание HBsAg 0,2 нг/мл) и отрицательный контроли, а также положительный контроль из набора Эритро-HBs с содержанием HBsAg 10 МЕ/мл. Разведением указанной концентрации положительного контроля физиологическим раствором (рН 7,2) получали содержание HBsAg 1 МЕ/мл и 0,5 МЕ/мл. Для проверки специфичности и отсутствия спонтанной реакции агрегации использовали образцы сывороток крови от больных гепатитом С, циррозом печени неинфекционной этиологии, доноров крови, не содержащие HBsAg.

На чистые обезжиренные предметные стекла наносили исследуемые образцы сывороток крови в объеме 0,025-0,03 мл, предварительно разведенные 1:4 физиологическим раствором (рН 7,2) и субмикронную монодисперсную стабильную эмульсию «Перфторан», несущую на своей поверхности антитела к HBsAg. Смешивание компонентов реакции производили легким встряхиванием предметного стекла в течение 30-60 сек. Через 10-15 мин регистрировали связывание гомологичных антигенов и антител, которое выражалось в образовании четко выраженных агрегатов субмикронных капель эмульсии ПФОС, визуально представленных пленкой, выявляющейся при легком покачивании предметного стекла, а остальная часть жидкости оставалась прозрачной. В отрицательных пробах капли ПФОС сохраняли свою гомогенность.

Результаты тестирования заведомо положительных в ИФА на HBsAg сывороток крови больных ОГВ - 29 чел. и ХГВ - 3 чел., показали совпадение результатов обоих методов. Агрегации капель ПФОС с образцами сывороток крови от больных вирусным гепатитом С (8 чел.), циррозом печени неинфекционной этиологии (7 чел.) и доноров крови (10 чел.) не наблюдалось. Положительный и отрицательный контроли ИФА-HBs агрегации капель ПФОС не вызывали. С контролем из набора Эритро-HBs реакция была положительной при концентрации HBsAg 10 МЕ/мл и 1 МЕ/мл. Кроме этого, исследовали сыворотки крови вновь поступивших на стационарное лечение 12 больных с подозрением на ОГВ, ранее не обследованных. Присутствие HBsAg в образцах сыворотки крови выявляли параллельно в ИФА и реакции агрегации эмульсии ПФОС.У 5 больных HBsAg обнаружили в ИФА и у тех же лиц предлагаемым способом.

При определении HBsAg в 7 образцах сывороток крови носителей, содержащих HBsAg по данным ИФА, в 6 случаях реакция агрегации была положительной, в 1 - сомнительная.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет выявить HBsAg в сыворотках крови больных гепатитом В.

Для демонстрации возможности использования реакции агрегации эмульсии ПФОС при определении сывороточных антител на ее поверхность сорбировали липополисахарид (ЛПС) S. typhi.

Пример 2. К 1 мл эмульсии ПФОС в глициновом буфере (рН 8,8) вносили 50-100 мкг ЛПС S. typhi производства США, фирма Sigma. Остальная процедура приготовления аналогична описанной выше. При определении уровня антител к ЛПС S. typhi проводили модельные опыты, применив в качестве положительного контроля адсорбированную агглютинирующую О-сыворотку, рецептор Vi, производства НИИВС, г.С.Петербург и «пул» образцов сыворотки крови доноров - отрицательный контроль. Готовились последовательные разведения сывороток начиная с 1:2 до 1:256 в физиологическом растворе (рН 7,2). Техника постановки реакции агрегации аналогична примеру 1. Агрегацию капель ПФОС-ЛПС S. typhi наблюдали в разведении сыворотки до 1:64, а с «пулом» образцов сыворотки крови доноров агрегацию не регистрировали.

Итак, предложенный способ позволяет выявлять антитела к S. typhi в исследуемой сыворотке крови.

Пример 3. К 1 мл эмульсии ПФОС в глициновом буфере (рН 8,8) вносили 3000 ТЕ туберкулина производства НИИВС, г.С-Петербург, разведенного до указанной концентрации согласно прилагаемой к препарату инструкции.

Смесь инкубировали 4 часа при комнатной температуре, а затем 18 часов при 8-10°С в условиях бытового холодильника. Удаление несвязавшегося белка проводили 3-4 кратной промывкой 5-кратным по объему глициновым буфером центрифугированием при 5000 об/мин ×7-10 мин.

Постановку реакции и учет результатов проводили, как в предыдущих примерах. 14 сывороток больных туберкулезом легких, диагноз у которых подтвержден бактериологически, и 12 здоровых лиц исследовали на наличие антител к М. tuberculosis предлагаемым способом и параллельно иммуноферментным анализом с помощью наборов ИФА-анти-ТУБ производства НИИ им.Л.Пастера, г.С-Петербург. Антитела выявлены у всех больных туберкулезом легких предлагаемым способом и у тех же больных в ИФА. В контрольной группе из 12 сывороток здоровых лиц антитела выявлены обоими методами только в 1 случае.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет выявить в исследуемых сыворотках антитела к возбудителю туберкулеза легких.

Длительное хранение диагностических препаратов (срок наблюдения 6 мес) не снижало их эффективности.

Таким образом, представлен способ, в котором используется субмикронная эмульсия перфторорганических соединений, никем ранее не предложенная в качестве носителя антигенов и антител для постановки иммунологических реакций.

Преимущества предлагаемого способа заключаются:

- высокая чувствительность способа;

- простота приготовления диагностикумов;

- быстрота постановки и учета результатов реакции, не требующая специального оборудования;

- стандартность и стабильность диагностического препарата;

- доступность и сравнительно низкая стоимость эмульсии перфторорганических соединений.

Предложенный способ может быть рекомендован для выявления антигенов и антител в имммунологических реакциях научно-исследовательскими, диагностическими и др. лабораториями.

Изобретение относится к области медицины, а именно к иммунологическим методам диагностики, и может быть использовано для обнаружения различных антигенов и антител. Предложен способ выявления антигенов и антител, состоящий в том, что в качестве носителя антигенов или антител используют субмикронную монодисперсную стабильную эмульсию перфторорганических соединений, капли которой способны адсорбировать на своей поверхности белки, липиды и др. Это свойство в совокупности с большой площадью поверхности (1 мл эмульсии составляет около 60 м²), позволяет получить антительный или антигенный диагностикумы. Полученные результаты свидетельствуют о высокой чувствительности способа, сходной с иммуноферментным анализом, простоте постановки реакции и учета полученных результатов.

Способ выявления антигенов и антител в сыворотках крови, состоящий во взаимодействии гомологичных антител и антигенов, отличающийся тем, что в качестве носителя антител или антиген используют субмикронную монодисперсную стабильную эмульсию перфторорганических соединений (ПФОС).