Способ определения антител к гликолипидам @ Советский патент 1985 года по МПК G01N33/48 

00

00 а Изобретение относится кмедици в частности к методам определения антител к липидным антигенам. Известен способ определения ан тител к гликолипидам Re и лепиду радиологическим методом ij . Известен также способ определе ния липидных антигенов с помощью содержащих в качестве маркера ион тетрапентиламмоний () , сенсиб лизированных линосом и ТПА ионселективного электрода f2 . .Недостатки способа заключаются в том, что необходим специальный синтез маркера и наличие в биолог ческих системах ионов , аналогичных маркеру. Целью изобретения является повышение точности способа. Указанная цель достигается тем что согласно -способу определения антител к гликолипидам Re путем встраивания липидного антигена в мембрану липосом, включения маркер внутрь липосомы, проведения реакции комплементаависимого лизиса с последующи - потенциометрическим определёнием по выходу маркера и лизированных липосом,в качестве маркера используют анион фтора. Способ осуществляют следующим образом. Ке-вакцину готовили следующим образом: культуру мутанита Salmonella minisota R595 с агара Хоттин гера смывали физиологическим раствором, ДОВОДИЛИ до концентрации клеток в 1 мл по оптическому стандарту ГИСК им.Тарасевича, прогревали 2 ч при и хранили при 4°С не более 30 дн.Перед иммунизацией животных Re-вакцину ресуспенд ровали, разводили стерильным физиологическим раствором до 10 клето в 1 мл. Вводили вакцинный препарат внут ривенно по следующей схеме: 1 день 0,25 мл; 5 день 0,5 мл; 9 день 1,0 мл; 14 день 1,0 мл. На 21 день брали. 40 мл крови, отделя сыворотку центрифугированием; Перед постановкой пробы гиперимунную сыворотку прогревали при 56°С 30 мин для инактивации компле мента и разводили ее ЭФР 1:100. IГликолипиды Re (ГЛ-Re) выделяют хлороформ-метанольной экстракцией из мутанта Salmonella minisota R595.Липиды А (ЛА) получают из ГЛкислотным гидролизом. Для реакции конкурентного ингиб рования ГЛ-Re и ЛА переводят в вод растворимое состояние комплексиров нием с бычьим сывороточным альбуми ном (БСА) в присутствии триэтилами на. Титры кроличьих гиперимунн.ых и контрольных сывороток предварительно оценивают по результатам реакции пассивной гемагглютикации (РПГА). РПГА проводят с формалинизированными эритроцитами человека гр.0(1)р-, .сенсибил1 зированными ГЛ-Re.Компонент исследуемых сывороток инактивируют прогреванием в течение 25-30 мин при 55-56 С. В реакции использован комплект сыворотки морской свинки (180 СН50 в 1 мл) . Липосомы готовят, используя яичный лецитин (Лн), холестерин (X), дицетилфосфат (ДФ) и ГЛ-Re в молярном соотношении Лн:Х:ДО:ГЛ-2:1, 5:0, 2:0,05 (обоснование соотношения представлено в У,УП условиях осуществления способа). Контрольные липосомы получают без гликолипида. Раствор липидов в хлороформе, содержащий 15 мг Лн; 5,8 мг X; 1,2 мг ДФ и 1 мг ГЛ-Re, высушивают на роторном вакуумном испарителе до образования липидной пленки. К высушенной липидной пленке добавляют 0,9-1,9 мл 0,14-0,15 М, NaF; 0,120-0,125 М Na НРО4; рН 7,3-7,4, тщательно встряхивают до образования гомогенной суспензии и озвучивают 4-5 раз по 20-30 с с охлаждением до 4-6°С, Невключившийся фторид натрия удаляют в течение 50-60 мин диализом против забуференного физиологического раствора (ЗФР; 0,120-0,125 М Ыа,2НРО4; 0,145-0,147 М NaCl; рН 7,37,4) при соотношении объемов 1:9001:1000. Процент удаления маркера контролируют измерением содержания ионов фтора ионселективным электродом в диализируемом растворе. Определение титров Re-антител в гипериммуной сыворотке кролика проводили следующим образом: в пять пробирок добавляли 100 мкл суспензии сенсибилизированных липосом, 4 мкл компя.емента (титр 180 CHjoB 1 мл) и различное количество гиперимунной сыворотки (разведенной 1:100). Объем каждой пробы доводили до 200 мкл ЭФР. Кроме этого ставили три контроля: пробы без комплимента, без гипериммунной сыворотки и с сывороткой неиммунизированных кроликов. Пробы инкубировали при 20°С в течение 30 мин. Коцентрацию ионов фтора определяли в объеме 100 мкл. На пластинчатый Ag/AgCl электрод сравнения помещали 100 мкл пробы и в вертикальном положении фотоселективный электрод (ЭР-У1). Анализируемый раствор занимал пространство между мембраной селективного электрода и пластинкой электрода сравнения. Разность потенциалов определяли с помощью универсального иономера ЭР-74, значение показаний электрода регистрировали через 3 мин. Для определения разности потенциалов пос-т ле полного разрушения липосом к | 100 мкл исходной суспензии сенсибилизированных липосом добавляли 80 мкл забуферного физраствора и 20 мкл (1,25%) тритон.

Пример 1.Кролика имйунизировали по стандартной методике многократно внутривенно Re вакциной,полученной из мутана Salmonella mini- sota R595, для определения иммуногенности четырех серий вакцинных препаратов. Титры Не-антител в кроличьих сыворотках оценивали описанным потенциометрическим методом в реакции иммунного комплементзави-симого лизиса липосом. Титры антител к гликолипидам Не для -четырех серий вакцинных препаратов состави ли 1:20000; 1:20.000; 1:20000 и 1:5000.

Пример 2. Иммунизацию кроика и определение титров антител к

гликолилидам Re для четырех серий вакцинных препаратов производили по примеру 1. Титры антител составили 1:20000; 1:20000; 1:20000 и 1:5000.

Изобретение упрощает метод выявлния антител к липидным антигенам за счет использования доступного маркера (NaF) и фторселективного электрода. Использованный в качестве маркера анион фтора практически отсутствует в биологических системах и не влияет на реакцию иммунного взаимодействия, так как степень тормозящего воздействия ионов в формировании иммунных комплексов параллельна обычному липотропному ряду. Кроме того, потенцирметрический ллпосомальный метод в 10 раз чувствительнее, чем известные -технические реше НИН.

1. СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ AHТИТЕЛ К ГЛИКОЛИПИДАМ Re путем встраивания липидного антигена в мембрану липосом, включения маркера внутрь липосомы, проведения реакции комплементзависимого лизиса с .последую- щим потенциометрическим определением по выходу маркера из лизированных липосоМ, отличающийс я тем, что, с целью повышения точности способа, в качестве маркера используют анион фтора. «о