Способ определения наличия злокачественного процесса Советский патент 1992 года по МПК G01N33/50 

Изобретение относится к медицине, в частности к клинической онкологии, и может быть использовано при диспансеризации населения с целью диагностического выявления методом выбора (скриннинга) больных со злокачественными новообразованиями, независимо от стадии и локализации опухолевого процесса.

Известен способ диагностики злокачественных новообразований путем определения активности ферментов в сыворотке крови человеке: изменение изоферментно- го спектра фермента лактатдегидрогеназы (ЛДГ). При сопоставлении активности изо- ферментов ЛДГ, а именно ЛДГе и ЛДП, определен термин индекс малигнизации, значение которого при злокачественном росте опухолей превышает единицу. Однако широкое использование этого способа диагностики лимитировано сложностью выполнения исследований, проводимых в клинико-диагностической лаборатории.

Известен способ ранней диагностики злокачественных новообразований путем определения в сыворотке активности фермента ДНКазы 1, оптимальное действие которого выявляется в слабо щелочной среде (рН 7,4) при обязательном присутствии ионов магния. Активность ДНКазы 1 в сыворотке крови человека определяют вискози- метрически по изменению вязкости коллоидного раствора ДНК после действия на него фермента. Находят относительную вязкость опытной пробы по отношению к воде до 2-часовой инкубации в термостате и после нее. Опытная проба состоит из реакционных компонентов: сыворотки крови, натриевой соли ДНК и раствора МдЗОд (ионы магния), т.е. реакция идет в присутствии ионов магния в слабо щелочной среде - рН крови 7,4, Активность фермента вырэжа 1

V4

-ч

О 00

О

ют в относительных единицах -угловых градусах: угол 90° означает, что относительная вязкость опытной смеси за время инкубации не изменилась, т.е. активность фермента ДНКазы 1 отсутствует. В сыворотке крови доноров (здоровые лица) активность ДНКазы 1 отсутствует. Клинически выраженный рак III-IV стадии также характеризуется отсутствием активности ДНКазы 1.

При наличии активности ДНКззы 1 в сыворотке крови диагностируют рак только на ранних стадиях (1-И).

Этот способ не находит широкого применения для диагностики рака, так как имеет ряд существенных недостатков:

1.ВыявЛяемость рака составляет всего 48,2%: из 29 случаев рака положительная активность ДНКазы 1 в сыворотке крови обнаружена только у 14 человек.

2.Отсутствует выявляемость III - IV стадии рака, особенно при недостаточно выраженной специфической симптоматике злокачественного роста.

3.Невозможно вискозиметрическое определение показателя количественного содержания перхлорнорастворимой фракции.

4.Способ не пригоден для диагностического выявления саркоматозных опухолей, при которых активность фермента чаще не выявляется.

5.Большие затраты времени на проведение анализа: время подготовки анализа, 2-часовая инкубация в термостате, по 5-6 отсчетов времени вытекания жидкостей в вискозиметре до и после инкубации, построение графика.

Целью изобретения является повышение точности и расширение функциональных возможностей способа.

Поставленная цель достигается тем, что определяют в сыворотке крови обследуемого лица магнийнезавиоимую ДНКазиую активность при рН 5,0-7,5 и одноврзменно показатель количественного содержания перхлорнорастворимой фракции (ПФС) спектрофотометрическим методом при 260 нм. При наличии магнийнезависимой ДНКазной активности и нормальном или повышенном показателе количественного содержания перхлорнорастворимой фракции диагностируют наличие злокачественного процесса, при отсутствии магнийнезависимой ДНКазной активности и одновременном повышении показателя количественного содержания перхлорнорастворимой фракции до 0,118 Е и более определяют наличие злокачественного процесса в запущенной стадии развития, т.е. с мета- стазированием; при отсутствии магнийнезависимой ДНКазной активности и

нормальном показателе количественного содержания перхлорнорастворимой фракции определяют отсутствие злокачественного процесса.

Сравнение чувствительности на рак по

стадиям заболевания по предлагаемому способу и прототипу иллюстрируется табл,1. Способ осуществляется следующим образом.

0 Процедура проведения анализа. Анализ можно производить, только если больной в ближайшие 3-5 месяцев не получал фитотерапии, химио- и лучевой терапии, не проводил самолечение ядами (например,

5 сулемой, креолином и т.д.), а также не принимал биологически активных вещесго (гормонов, нуклеотидов, адаптогенов и т.д.).

I.Подготовка анализа.

а)Приготовление extempore 0,05% рас- 0 твора ДНК на 0,1 М ацетатном буфере: слегка перемешав коллоидный раствор ДНК, ставят его на ледяную баню на 1 ч, изредка перемешивая мягким встряхиванием. Все растворы и штативы с пробирками держат

5 на ледяной бане и хранят в холодильнике. Затем раствор ДНК перед употреблением щадяще центрифугируют.

б)Подготовка сыворотки: забор крови производят натощак свободным вытекани0 ем (одной только иглой). Сыворотку быстро отделяют и держат на ледяной бане. Перед употреблением ее разводят ледяным физраствором в 10 раз (1:9 по объему), перемешивают путем сильного встряхивания и

5 отсасывают пастеровской пипеткой образующуюся пену, которую отбрасывают. Разведенную сыворотку держат на ледяной бане.

II.Проведение анализа.

1). Разлив реактивов производят в поли- 0 этиленовые пробирки (объемом 3,5-4 мл) в ледяной бане в следующем составе и порядке:

а)опытные пробы: (5 параллелей) - к 1 мл 0,05% раствора ДНК приливают 1 мл

5 разбавленной в 10 раз сыворотки;

б)контроль I (5 параллелей) - на содержание нуклеотидов в растворе ДНК: к 1 мл физраствооа приливают 1 мл 0,05% раствора ДНК.

0 в) контроль II (5 параллелей) (на количественное содержание перхлорнераствори- мой фракции в сыворотке крови): к 1 мл ацетатного буфера приливают 1 мл разбавленной в 10 раз сыворотки кроаи;

5 2), Инкубация после перемешивания путем тщательного встряхивания всех проб при 37°С в течение 30 мин на водяной бане. 3). Остановка ферментативной реакции путем быстрого помещения всех проб в ледяную баню и быстрого добавления в кэхдую пробу по 1 мл раствора НС1См(до конечной концентрации в реакционной смеси 0,5 М Н.СЮд). После тщательного встряхивания пробы оставляют на 1 ч в ледяной бане для лучшего формирования осадка.

4). Центрифугирование при 4000 об/мин в течение 10 мин,

5). Слив надосадочной жидкости и спек- трофотомегрирование при 260 нм.

6). Расчет магнийнезависимой ДНКаз- ной активности и выражения показателя количественного содержания перхлорнора- стеоримой фракции сыворотки(ПФС) крови:

а) рассчитывают истинную оптическую плотность в экстинкциях опытной пробы (ДЕ0) путем вычитания из среднеарифметического показателя оптической плотности опыта суммы среднеарифметических пока- спелей плотности обоих контролен I и II по формуле

(Ек1 + Еки).

Обнаружение положительной ферментативной активности следует считать со значения ДЕ0 20 Е и выше с учетом расхождения в параллельных пробах (±10Е) и возможной ошибки прибора (±5 - 10 Е). ДНКазную активность условно можно выражать в величинах АЕо в экстинкциях.

По международной системе СИ производят расчет в мкмоль/(л мин) кислотораст- воримых нуклеотидов, образовавшихся за 1 мин инкубации 1 л сыворотки крови с субстратом ДНК. Количество мкмолей кислото- растворимых продуктов гидролиза ДНК находят по калибровочной кривой, построенной для АМФ или по коэффициенту пересчета К, выведенному по этой кривой.

Расчет по формуле:

АЕОХ 10000 х К

30

где 10000 - пересчет объема 0.1 мл сыворотки крови в реакционной смеси на 1 л сыворотки; 30 - количество минут инкубации проб.

Показателем количественного содержания перхлорнорастворимой фракции в сыворотке крови (ПФС) служит среднеарифметический показатель оптический плотности контроля И, выраженный в экстинкциях.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Больная В., 1933 года рождения, ист. болезни № 2334/м, прооперирована в гинекологическом отделении Ростовского НИИ онкологии с диагнозом: рак тела матки, стадия II; гистоанализ: аде- нокарцинома тела матки с инвазией мышечного слоя (№ гистоанализа: 290 269-78).

Диагностический анализ крови до операции: от 15.03.88.

ДНКазная активность 0.756 мк моль/л/мин, показатель ПФС - перхлорно- 5 растворимой фракции сыворотки 0,162 Е.

Пример 2. Больная М., 1922 года рождения, история болезни № 7073/Ф, прооперирована в институте, в гинекологическом отделении, с диагнозом: кистома

0 правого яичника и миома матки (№ гистоанализа 236 496-502).

Диагностический анилиз: кровь до операции от 22.06.88.

ДНКазная активность 0; показатель

5 ПФС 0,065 Е.

Пример 3. Больная Т., 1935 года рождения, N° ист. болезни 501/Ф. прооперирована в гинекологическом отделении института с диагнозом: рак яичников, стадия

0 IV. Гистоанализ Nfe 228 566-79: цистодено- карцинома с метастазами в большой сальник. Диагностический анализ крови от 14.01.88 до операции: ДНКазная активность 0. показатель ПФС 0,218 Е.

5Доказательства положительного эффекта, предлагаемого способа представлены в табл 2.

Эффективность способа диагностики, способа определения злокачественного

0 процесса. состоит в его высокой чувствительности (96%) при достаточной точности (82.7%) к наличию злокачественного роста в организме больного и, следовательно, высокой степени выявляемое™ онкологических

5 заболеваний. Заявляемый способ отличается простотой выполнения, небольшой затратой времени (на обследование 2-4 человек не более 3 ч) - анализы идут параллельно, не требу ют использования сложной,

0 уникальной аппаратуры, и может найти широкое применение при диспансеризации населения как диагностический метод скриннинга (выбора) по определению наличия злокачественного новообразования в

5 организме человека с целью выявления лиц, нуждающихся в тщательном онкологическом обследовании и дальнейшем проведении специфического лечения.

Формула изобретения

0 Способ определения наличия злокачественного процесса путем биохимического исследования сыворотки крови, отличающийся тем, что, с целью повышения точности и расширения функциональных

5 возможностей способа, в сыворотке крови пациента определяют магнийнезависимую ДНКазную активность при рН 5,0-7,5 и количественное содержание перхлорнорастворимой фракции спектрофотометрически при 260 нм, и при ДНКазной активности

определяют наличие злокачественного процесса, о при отсутствии магнийнезависимой ДНКаэной активности и одновременном повышении показателя количественного содержания перхлорнорастворимой фракции до 0,118 Е и более определяют наличие злокачественного процесса с метастазировэнием.

Использование: при диспансеризации населения с целью выявления больных со злокачественными новообразованиями. Цель: повышение точности и расширение функциональных возможностей способа. Сущность изобретения: в сыворотке крови определяют магнийнезависимую ДНКаз- ную активность при рН 5,0-7,5 и количественное содержание перхлорнорастворимой фракции. При ДНКазной активности определяют наличие злокачественного процесса, а при отсутствии магнийнезависимой ДНКазной активности и одновременном повышении показателя количественного содержания перхлорнорастворимой фракции до 0,118 Ей более определяют наличие злокачественного процесса с метастазирова- нием. Положительный эффект высокая чувствительность при достаточной точности

Таблица Ј

Количество ложноотрицательных и ложноположительных ответов по диагностическим анализам, выполненным предлагаемым способом

Редактор Г, Вельская

Техред М.Моргентал

Заказ 4120ТиражПодписное

ВНИИП1/1 Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж-35. Раушская наб., 4/5

Корректор О. Кравцова