Способ определения активного реабилитационного резерва у больных хроническими неспецифическими заболеваниями легких Советский патент 1992 года по МПК G01N33/68 

Изобретение относится к медицинской биохимии и лабораторной диагностике.

Целью изобретения является повышение точности оценки общего энергетического уровня организма и активного реабилитационного резерва (на примере больных хроническим бронхитом, для проведения у данных больных и инвалидов наиболее адекватных реабилитационных мероприятий, направленных на полное или частичное восстановление утраченных функций).

Поставленная цель достигается тем, что и после физической нагрузки у обследуемых лиц проводится забор кроеи натощак и в плазме крови определяются исходные биохимические показатели липидного обмена (общие липиды, суммарные ацилглицериды, свободные жирные кислоты, перекиси липидов - ТБК - активные продукты), показатели гликолиза (молочная кислота, ЛДГ - прямая) и цикла Кребса (яблочная кислота и МДГ - обратная).

Нагрузка проведена по Мастеру, умеренная, с энергозатратой в среднем 30- 32 ккал/мин (2-ступенчатая лестница, в течение 5 мин, 300 шагательных движений).

Способ осуществляется следующим образом.

Уровень общих липидов в плазме крови определяют унифицированным методом с фосфорно-ванилиновым реактивом с помощью наборов фирмы Лахема.

Общие ацилглицериды и содержание свободных жирных кислот изучают методом тонкослойной хроматографии на пластинах Силуфол. Выпаренный липидный экстракт (по Фолчу) из 100 мкл плазмы крови раство VJ

ХЗ О

00 V4

ряют в 40 мкл смеси хлороформ-метанол (3:1), наносят на пластину (10 мкл) и помещают в хроматографическую камеру, насыщенную системой растворителей: петролейный эфир - диэтиловый эфир - ледяная уксусная кислота (30:10:0,2). После хроматографии пластины высушивают, опрыскивают 5% спиртовым раствором фосфорно-молибде- новой кислоты и выдерживают при 100°С (5 мин). Фракции липидов (общие фосфолипи- ды на старте, свободный холестерин, свободныежирныекислоты, монодиглицериды, триглицериды,эфиры холестерина) соскабливают в Центрифужные пробирки, используя предчоженный метод элюировачия фракций 2.5 мл бидистилли- рованной воды, через 10 мин пробы центрифугируют (10 мин) и измеряют оптическую плотность при 530 нм. Рассчитывают процентное содержание фракций и пересчитывают на количественный уровень общих липидов (г/л), В дальнейшем используют суммарную фракцию монодитриацилглице- ридов и свободных жирных кислот как лег- коокисляющихся энергетических субстратов.

Перекиси липидов (продукты, реагирующие с тиобарбитуровой кислотой, ТБК- активные продукты) определяют разработанным методом исследования продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ)(перекиси липидов, конъюгированные диены и диенкетоны) в одном липидном экстракте (по Фолчу), полученном из 1 мл плазмы кроаи. После разделения фаз водно-метэнольной фазы (верхней) дополнительно экстрагируют полярные продукты окисления липидов диэтиловым эфиром (3 мл). Хлороформный (нижний) и эфирный (верхний) экстракты объединяют и делят на две пробирки: I - 0,5 мл, II - 3,0 мл. Экстракты выпаривают. В 1-й пробирке осадок растворяют 2 мл смеси н-гептан-изопропи- ловый спирт (1:1) и определяют оптическую плотность раствора при 232 нм (коныогиро- ванные диены) и 273 нм (диенкетоны) на СФ -16, Во 2-ю пробирку дл я определения продуктов, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой (ТБК), к выпаренному осадку добавляют 2,5 мл 0,05 М раствора серной кислоты и 3 мл раствора ТБК концентрации 2 мг/мл в 2 М растворе сернокислого натрия. Пробирки помещают о кипящую водяную баню на 30 мин. охлаждают. Образовавшийся цветной комплекс экстрагирует 4 мл н-Су1анолэ, энергично встряхи- вэют.центрифугируютЮмин при 3000 об/мин и фотометрируют при 530 нм на СФ-26. Рассчитывают процентное содержание изученных продуктов ПОЛ, взяв сумму экстинкций

за 100% и затем пересчитывают на общие липиды (г/л). Данный метод расчета продуктов ПОЛ применен впервые, Для дальнейшего расчета использован показатель

ТБК-активных продуктов (перекиси липи- доа).

Для определения молочной кислоты (МК) используют метод, основанный на дегидрировании ЛДГ в присутствии НАД:

Лактат+НАД ЛДГор пируват + НАД Н2.

По количеству образовавшегося НАД На судят о содержании МК.

Реактивы:

1. Гидразинглициновый буфер рН 9.5 (18,75 г глицина, 13,0 г гидразинсульфата, 500 мг ЭДТА растворяют в дистиллированной воде, доводят рН до 9,5 насыщенным раствором NaOH и общий объем доводят до 250 мл.

2.НАД (10 мг в 1 мл бидистиллирован- ной НаО).

3.Суспензия лактатдегидрогеназы. Ход анализа: в опытную пробирку помещают 2,75 мл гидразинглицинового буфера (рН 9,5), 0,1 мл раствора НАД и 0,25 мл экстракта плазмы крови; в контрольную пробу - 0,25 бидистиллированной НаО, Замеряют оптическую плотность раствора при

340 нм, добавляют 0,02 мл ЛДГ и через

30 мин повторно замеряют на СФ-26.

q 1 . о Расчет МК Е -

6,22 10 6 -Е 3,98 ммоль/л

где Е - разница экстинций между опытной л контрольной пробами до и после добавления суспензии ЛДГ;

3,1 - объем анализируемой пробы; 6,22 105 - коэффициент экстинций НАД Н2 при длине волны 340 нм, который соответствует величине поглощения 1 моль вещества в 1 мл раствора, при толщине слоя 1 см;

8 - расчет на 2 мл плазмы крови. Получение безбелкового экстракта: 2 мл плазмы смешивают с 2 мл HCI04, центрифугируют 10 мин, Надосадочную жидкость переливают в другую пробирку, добавляют по 1 капле раствора метилоранжа, перемеши- вают и титруют углекислым калием (69 г в 100 мл Н20) до изменения окраски. Центрифугируют.

Для определения яблочной кислоты ис- пользуют те же реактивы и суспензию ма- латдегидрогеназы. Принцип метода основан на дегидрировании НАД-содержа- щего фермента малатдегидрогеназы (МДГ) в присутствии НАД:

-Щ. Малат+НАД щавелевоуксусная

кислота -I НАД-На.

По степени убыли восстановленного НАД и образования НАД окисленного спек- трофо.ометрически определяют концентрацию ЯбЛОМНОЙ КИСП01Ы.

Ход анализа: в химическую пробирку вносят 2,5 мл гидразинглицинового буфера (рН 9,5), 0,1 мл НАД и 0,5 мл экстракта плазмы крови, Контроль - 0,5 мл N20. Замеряют оптическую плотность проб, добавляют 0,02 мл суспензии МДГ и повторно спектрофото- метрируют.

3.1 4 б

Расчет: ЯК Е

6,22 10

Ј1,99 ммоль/я. где 4 - расчет но 2 мл плазмы крови.

Определение активности прямо 1 лак- татдегидрогеиазы проводят спекфофото- метрическим методом ЛДГ - гликолитичг.ский, ИАД-оодержащий фермент, катализирующий восстановление в аэробных условиях пировиноградной кис лоты до молочной:

-ЛДГпр,

ПВК НАД-Н2 4 МК НАД.

Ризктивы:

1. Фосфашый буфвр, рН 7,8.

2 НАД-На (12 MI pdCTBOpiiOT в 16 мл бидистиллированной ИаО)

3. Пировиноградная кисло га (5 мг растворяют в 5 мл фосфатного буфеоа. рН 7,8).

Перед работой готовят инкубационную смесь Мг 1: 25 мл фосфатного буфера, 4 мл НАД-На и 1 мл пирувата, и смесь № 2:25 мл фосфатного буфера, 4 мл НАД-На и 1 мл бидистиллированной воды.

В опытную пробирку берут 3 мл инкубационной смеси № 1, в контрольную - 3 мл смеси № 2. В обе пробирки добавляют по 0,1 мл разведенной плазмы (1:10 - 0,2 мл плазмы + 2 мл НаО). Инкубируют пробы 3 при 3/°С в течение 30 мин. Реакцию останавливают, помещая пробирку в охлажденную воду на 1-2 мин, и замеряют оптическую плотность проб при 340 нм на СФ-16.

Расчет проводят по формуле г (Ек-Ео) Ю Ю

30

25,696 (мМ/ч/л),

где 10 - разведение плазмы:

10 - пересчет на 1 мл плазмы;

25,696 - коэффициент пересчета на

мМ/ч/л.

В основе метода определения обратной

малатдегцдрогеназы лежит реакция:

щ

ЯК + + НАД-На

При нейтральном значении рН равновесие реакции сдвинуто влево.

По снижении экстинции НАД На судят об активности МДГ обратной. Используют

5 те же реактивы, что и при определении ЛДГ прямой, только вместо субстрата пирувата используют субстрат щавелевоуксусной кислоты (ЩУК) (4 мг растворяют в 3 мл фосфатного буфера, рН 7,8) и в смесь N; 1 добав0 л я ют 1 мл ЩУК,

В опытную пробирку вносят 3 мл смеси № 1, в контрольную - 3 мл смеси № 2. В обе пробирки добавляют по 0,1 мл разведенной плазмы (1:10). Инкубируют при 37°С в тече5 ние 30 мин. Реакции останавливают, по- мешая пробирки в холодную воду на 1-2 мин, и замеряют оптическую плотность при 340 им не СФ-26.

Расчет МДГ обратной проводят по фор0 муле для ЛДГ прямой.

На основании исходных биохимических показателей рассчитывают комплексный показатель оценки активного реабилитационного резерва по формуле

5л ОАГ ЖК

А - -°АГ

ПП МК-МДГ

-(ПЗУ жиров) н (ПЗУ углеводов),

ЯК -ЛДГ

U A - показатель реабилитационного ре- 0 зервэ;

ОАГ - общие эцилглицермды; ЖК - жирные кислоты; ПЛ - перекиси липидов (ТБК-активные продукты);

5 ПЗУ жиров - показатель энергетическо го уровня жиров,

МК - молочная кислота; ЯК - яблочная кислота, МДГ - малатдегидрогеназа; 0 ЛДГ - лактатдегидрогеназа:

ПЗУ углеводов-показатель энергетического уровня углеводов.

В конкретном случае, для разработки способа определения реабилитационного 5 резерва, в клинических условиях обследованы здоровые лица - 21 чел. и 74 больных (инвалидов) хроническими неспецифическими заболеваниями легких, с разной степенью легочной недостаточности. 0Данные представлены в таблице.

Выделено три уровня реабилитационного резерва:

-активный (высокий показатель А до и после физической нагрузки, в среднем от

5 3,00 до.5,00),

-умеренный (снижение показателя А в исходном состоянии не более чем на 50% до нагрузки (от 2,00 до 3,00): после нагрузки не изменяется или увеличивается).

- отсутствует (снижение показателя А более чем на 50% до нагрузки (2,00) и дальнейшее снижение его после нафузки

В группе здоровых лиц (21 чел.) при высоком исходном уровне после физической нагрузки А снижается только в трех случаях, оставаясь на высоком уровне у двух человек (8,56 - до нагрузки и 5,5 - после нагрузки; 4,65 и 3,96 соответственно).

Существенное снижение в группе здоровых после нагрузки определено только в одном случае (7,55 - до нагрузки и 1,99 - после нагрузки). В остальных случаях у здоровых лиц реабилитационный резерв после нагрузки не изменяется или определяется как положительный при высоком иг одном уровне.

У больных ХНЗЛ с явлениями легочной недостаточности 0-I и ст. (у 37) при сниженном исходном уровне (в среднем на ) в 80% случаях (у 31 из 37) после нагрузки определяется положительный реабилитационный резерв

У больных ХНЗЛ при ЛН I II, I ст (23 чел.) исходный уровень ОПЭУ снижен в среднем более чем на 60% (от 50 до 80%) Только у 5 больных данной группы после физической нагрузки происходит незначительное увеличение уровня ОПЭУ, оставаясь ниже, чем у здоровых и больных с ЛН 0-I, I ст. В остальных случаях (18 чел , что составляет 80%) происходит дальнейшее снижение ОПЭУ, что определяет отсутствие активного реабилитационного резерва

Изобретение иллюстрируется следующими примерами

Пример 1. Косяк В В , практически здорозый, 48 лег Обследован в контрольной группе. Профессия - инженер-наладчик. Лабораторные данные: оЬщие липиды (ОП) 7,40 г/л - до нагрузки, к,60 г/л - после нагрузки, общие зцилглпцериды (ОАГ) 1,38 и 1,87 соответственно; перекисний показатель (ЛП) 0.43 и 0,91; ПЗУ жиров 3,18 и 3,09, ПЗУ углеводов - 2,78 и 3.90, ОПЭУ - 5.96 и 5,99. Реабилитационный резерп не изменен. Заключение, применяемая умеренная нагрузка не вызывает существенных изменений о гомсостазездорового человека и не требует напряжения энерюсистемы для обеспечения адаптации к данной нагрузке. Пример 2, Больная Курапина Е.В , 45 лет, образование - среднее специальное, профессия -лаборант, рабочая пьнозавода. Труд физический, тяжелый с вредными условиями. Поступила для реабилитации и ре- шенил вопроса с трудоспособности. Лабораторные данные: общие липиды 4,44 г/л -- до нагрузки, 4,55 г/л - после нагрузки; общие ацшилицериды 1,00 и 1,06

соответственно; ПП 1,21 и 0,71 ПЕУ жиров 0,83 и 1,49; ПЗУ углеводов 4,00 и 1,19; ОПЭУ 4,83 и 2,68. Диагноз: хр. бронхит с бронхос- пастическим синдромом без признаков леточной недостаточности; хр. холецистит, Л81 кая форма; хр. гастрит с пониженной секреторной функцией и умеренным болевым синдромом. Заключение: больная имеет высокий общий показатель энергетического

уровня, который остается высоким и после нагрузки, компенсаторно снижаясь. Больная признана трудоспособной. Рекомендованы ограничения по линии ВКК и проведение активных и реабилитационных

мероприятий.

Пример 3. Больная Лукьянчик Н.С.. 51 юд, поступила для решения вопроса о трудоспособности, образование 6 классов, профессия - шлифовщица, труд тяжелый,

Не работает. Лабораторные данные: ОЛ 4 88 до нагрузки; ОАГ 1,25 и 1,40 соответственно; ПП 0,83 и 0,84; ПЗУ жиров 1,51 и 1,67; ПЗУ углеводов 1,52 и 2,06; ОПЭУ 3,03 -до нафузки, 3,73 - после нагрузки. Диагноз:

бронхиальная астма инфекционноаллерги- ческого генеза, легкая форма; хр. бронхите бронхоспастическим синдромом, ЛН I ст,; кардиосклероз атеросклеротический и дистрофический с умеренными изменениями в

миокарде, Н ст.

Заключение: реабилитационный резерв положительный при пезначителыюмсниже- нии исходного ОПЗУ. Учитывая профессию, больная признана инвалидом III фуппы, и

рекомендовано проведение активных реабилитационных мероприятий.

Пример 4. Больная Растило Ф.И., 52 года, образование - неполное среднее, профессия - строитель, Не работает. Поступила

для решения вопроса о трудоспособности и реабилитации.

Лабораторные данные: ОЛ 3,15 - до нагрузки, 3,15 - после нагрузки; ОАГ 0,73 и 0,84 соответственно; ПП 2,28 и 1,88; ПЗУ

жиров 0,32 и 0,45; ПЗУ углеводов 1 ,6 и 1,26; ОПЭУ 1,58 - до нагрузки и 1,71 - после нагрузки

Диагноз: хронический обструктивный бронхит с образованием бронхоэктазов и

бронхоспастическим синдромом; прикорневой пнсвмосклероз. Умеренная эмфизема легких, ЛН 1-Й ст. Атеросклероз аорты, кардиосклероз атеросклеротический и дистрофический с выраженными изменениями в

миокарде, мерцательная аритмия, Н I ст. Персистирующий гепатит,

Заключение: слабоположительный реабилитационный резерв при низком исходном энергетическом уровне.

Рекомендовано проведение адекватных реабилитационных мероприятий.

Пример 5. Больной Кочнев И.Г., 53 года, образование среднее специальное. Профессия - токарь V разряда. Инвалид II гр. с 1985 г., не работает с 1978 г. Поступил для решения вопроса о трудоспособности и реабилитации.

Лабораторные данные: ОЛ 3,27 - до нагрузки, 3.11 - после нагрузки; ОАГ 0,67 и 0,83 г/л соответственно: ПП 1,43 и 2,18; ПЗУ жироо 0,47 и 0,37; ПЗУ углеводов 0,35 и 0,44; ОПЭУО,82иО,81.

Диагноз; хроническая пневмония II ст. с наклонностью к обострениям, протекающая по перибронхиальному типу; хр. обструк- тивный бронхит с брохоспастическим синдромом. Резекция правого легкого в 1974 г. по поводу твс. Умеренная эмфизема легких, диффузный пневмосклероз, ЛН II ст.

Заключение: больной признан инвалидом II группы. Реабилитационные резервы не изменяются при резком снижении общего энергетического уровня. Больной относится к группе слабореабилитируемых.

Пример 6. Больной Подберский С.Е., 46 лет, образование - среднее специальное, профессия - начальник цеха. Поступил для решения вопроса о трудоспособности и реабилитации.

Лабораторные данные: ОЛ 3,11 г/л - до нагрузки, 1,78 г/л - после нагрузки; ОАГ 0,67 и 0,30 г/л соответственно; ПП 1,20 и 1,55; ПЗУ жиров 0,56 и 0,19; ПЗУ углеводов 0,21 и 0,20; ОПЭУ 0,77 - до нагрузки, 0,39 - после нагрузки.

Диагноз: хронический обструктивный бронхит, диффузный пневмосклероз; умеренная эмфизема легких. ЛН II ст.; гипертоническая болезнь I ст.; кардиосклероз атеросклеротический и дистрофический без

выраженных изменений в миокарде, хронический гастрит; язвенная болезнь жепудка в стадии рубцевания.

Заключение:больной нетрудоспособен, с резким снижением общего энергетического уровня и отрицательным реабилитационным резервом. Показано проведение лечебных мероприятий.

Формула изобретения Способ определения активного реабилитационного резерва у больных хроническими неспецифическими заболеваниями легких, включающий измерение до и после физической нагрузки содержания в плазме крови общих липидов, общих ацилглицери- дов, жирных кислот, уровня ТБК-активных продуктов, молочной кислоты, яблочной кислоты, активности ЛДГ и МДГ с последующим расчетом показателя реабилитационного резерва по формуле

. OAI /КК /.-,«,, ,

А pjj(ПЗУ жиров) +

МК МДГ ,п,,..ч

+ ЯК .ЛДГ-(ПЭУ углеводов),

где А- показатель реабилитационного резерва;

ОАГ - содержание ацилглицеридов;

ЖК - содержание жирных кислот;

ПЛ - уровень ТБК-активных продуктов;

ПЗУ жиров - показатель энергетического уровня жиров;

МК - уровень молочной кислоты;

ЯК - уровень яблочной кислоты;

ЛДГ и МДГ - соответственно активность лактат и малатдегидрогеназ;

ПЗУ углеводов - показатель энергетического уровня углеводов, и при значении полученного показателя до нагрузки в пределах от 3,0 до 5,0 и дальнейшем его увеличении после физической нагрузки определяют наличие активного реабилитационного резерва.

Использование: медицинская биохимия, лабораторная диагностика. Сущность изобретения: в плазме крови до и после физической нагрузки определяют исходные биохимические показатели липидного обмена (общие липиды ОЛ. общие ацилглицери- ды ОАГ, жирные кислоты ЖК, перекиси липидов ПЛ), гликолиза (молочная кислота МК, лактатдегидрогеназа прямая ЛДГПр.( и цикла Кребса (яблочная кислота ЯК и малат- дегидрогеназа обратная МДГ0бр.)и на основании их рассчитывают комплексные показатели: перекисный показатель ПП ПЛ/ЖК; показатель энергетического уровня жиров ПЗУ жиров ОАГ/ПП, показатель энергетического уровня углеводов ПЗУ углеводов МК/ЯК: ЛДГпр./МДГобр ; общий показатель энергетического уровня ОПЭУ ПЭУ жиров + ПЗУ углеводов. По общему показателю энергетического уровня в исходном состоянии и после нагрузки определяют 4 вида реабилитационного резерва: оптимальный при ОПЭУ до нагрузки 4,9б± ±0,25, после нагрузки 5.08±0,29: положительный 2,75±0,18 и 3,15±0,21 соответственно; слабоположительный 1,93±0,17 и 2,08±0,13 соответственно: отрицательный 1,15±0,09 до нагрузки, 1,06±0.11 после нагрузки, 1 табл.

Основные показатели определения реабилитационного резерва у больных ХНЗЛ

Продолжение таблицы