Изобретение относится к ветеринарной вирусологии, в частности, к получению штамма перевиваемых клеток - продуцента вируса лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС), используемого для размножения ВЛКРС, а также для приготовления антигенов ВЛКРС для серологических реакций и для специфической профилактики ВЛКРС-инфекции.
Цель изобретения - получение штамма перевиваемых клеток, хронически инфицированного отечественным штамг мом ВЛКРС, интенсивно продуцирующего ВЛКРС и его антигены и обладающего способностью хорошо репродуцироваться на отечественных средах с коммерческой сывороткой крупного рогатого скота.
Цель достигнута благодаря получению нового штамма перевиваемых клеток легкого эмбриона КРС (ЛЭК-ВИЭВ-90), продуцента ВЛКРС.
Полученный штамм обладает следующими свойствами.
Морфологические признаки. Клетки ЛЭК-ВИЭВ-90 растут на поверхности стекла в виде однослойной культуры. По морфологии клетки штамма однородные фибробластоподобные, отросчатые вытянутой формы. Ядро у них овальной формы, расположено эксцентрично, содержит 2-Ц ядрышка округлой формы. В
XI
ч
00 00
ел
популяции преобладают клетки с диплоидным набором хромосом.
Физиологические признаки. Клетки штамма растут в виде монослоя в ере- де ФГМ-С с добавлением 10% сыворотки крупного рогатого скота, не содержащей антител к ВЛКРС. Оптимальная плотность посева составляет 2 i i10 клеток/мл. Монослой формируется на 3 сутки. С поверхности стекла клетки снимаются 0,02% раствором Вер- сена, индекс пересева составляет 1:5.
Штамм клеток не контаминирован ми- коплазмами и цитопатогенными вируса- ми.
Штамм клеток легкого эмбриона коровы ВИЭВ-90, хронически инфицированный ВЛКРС, получен путем сокультиви- рования первичнотрипсинизированной культуры клеток легкого эмбриона ко- ровы (2 пассаж) с лимфоцитами крови инфицированной ВЛКРС и больной лейкозом коровы (диагноз гистологически, подтвержден). Соотношение клеток лв(- кого эмбриона коровы и лимфоцитов крови составляло 1:2, время адсорбции часов, температура Зб,,5°С.
Пример. Клетки штамма культивируются в стеклянных матрасах при температуре 37,0°С в питательной среде, состоящей из среды ФГМ-С, 10% сыворотки крупного рогатого скота и антибиотиков (пенициллина и стрептомицина по 500000 ед/л). Оптимальная плотность посадки клеток штамма составляет 2-Ю5 клеток на 1 мл среды. Монослой формируется через 3 суток При пересеве клетки с поверхности стекла снимают подогретым до 37°С 0,02% раствором Версена.
Коэффициент пересева равен 1:5.
Клетки штамма продуцируют в питательную среду ВЛКРС и его антигены. Продуцируемый клетками штамма вирус . идентичен исходном;/ вирусу, использованному для заражения клеток. Под электронным микроскопом продуцируемый клетками ЛЭК-ВИЭВ-90.вирус имеет типичную для вирусной частицы типа С морфологию, т.е. состоит из центрально расположенного электронно- плотного нуклеотида диаметром 60- 90 нм, между нуклеотидом и двухслойной внешней мембраной вириона располагается электронно-прозрачная проме- жуточная зона,
; Размер зрелого вириона составляет 80-120 нм.
Q
5
0 5
0
0 55
5
0
5
Продукция ВЛКРС этим штаммом выявляется с помощью реакции диффузионной преципитации в агаровом геле (РИД) с использованием тест-системы для идентификации антигенов ВЛКРС (сыворотка крупного рогатого скота, содержащая антитела к гликопротеидному антигену вирусной оболочки ВЛКРС (qp50, сыворотка крупного рогатого скота, содержащая антитела к протеидному антигену ВЛКРС (р24) , коммерческий антиген ВЛКРС, содержащий qp51 и р24.
Число пассажей в течение которых штамм сохраняет вирус-продуцирующую способность равно 30, продукция вируса штаммом клеток колеблется от 4-10
О
до 1 10 вирионов на 1 мл среды.
Для практического использования в РИД, слитую на день культуральную жидкость (ЮК), содержащую вирус и его антигены, концентрируют.
Для этого к КК добавляли полиэти- ленгликоль (ПЭГбООО) до конечной концентрации 20% и хлорид натрия до конечной концентрации 0,5 М и, после их растворения, инкбировали в течение 1б часов при 4,0 С. Затем образовавшийся преципитат отделяли центрифугированием при 10 000 об/мин в течение 30 мин. Надосадочную жидкость декантировали, з осадок ресуспендировали в 0,05 М трис HCl-буфере (рН 7,2-7,4) . Полученную жидкость осветляли центрифугированием при 8000 об/мин в течение 30 мин. Полученная в результате этого жидкость содержала растворимые антигены ВЛКРС и использовалась в РИД. Соотношение начального (ЮК) и конечного объемов (надосадочная жидкость после второго центрифугирова- . ния) было 10:1. Один мл. полученного концентрата содержал 50 доз антигена, используемого в РИД.
Предложенный штамм перевиваемых клеток легкого эмбриона крупного рогатого скота ВССК (СХЖ) № kl - продуцент вируса лейкоза крупного рогатого скота депонирован в коллекции диплоидных культур Всесоюзного научно-исследовательского института экспериментальной ветеринарии им. Я.Р.Коваленко, ВЛСХНИЛ, г.Москва, под Р 41.
Предложенный штамм клеток обладает следующими преимуществами:
являясь штаммом перевиваемых хронически инфицированной ВЛКРС клеток, он способен долго, не вырождаясь, интенсивно продуцировать отечественный
5 17781856
штамм вируса лейкоза крупного рогато-ровом геле, которая служит для выявго скота и его антигены,ления животных, инфицированных ВЛКРС.
штамм клеток способен репродуциро-Утамм перевиваемых клеток ЛЭК- ваться на отечественных средах, ко- ВИЭВ-90 может быть использован для торые изготовляются без использованиябиофабричного производства антигенов компонентов, не производящихся в на-ВЛКРС. шей стране, с добавлением коммерческой сыворотки крупного рогатого ско-Формула изобретения та.10
Сконцентрированная в 10 раз куль-Штамм перевиваемых клеток легкого
туральная х идкость ЛЭК-ВИЭВ-90 можетэмбриона крупного рогатого скота
быть использована в качестве антиге-ССКК (СХК) К И - продуцент вируса
нов ВЛКРС, используемых в РИД в ага-лейкоза крупного рогатого скота.
| название | год | авторы | номер документа |
|---|---|---|---|
| ШТАММ 8С12 ПОСТОЯННОЙ МЕЖВИДОВОЙ ГИБРИДНОЙ ЛИНИИ КЛЕТОК МЫШИ Mus. musculus И ОВЦЫ Ovis aries - ПРОДУЦЕНТ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К ГЛИКОПРОТЕИДНОМУ АНТИГЕНУ ВИРУСА ЛЕЙКОЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА | 2008 |
|
RU2377297C1 |
| Клеточная линия тимуса эмбриона крупного рогатого скота мва-76 "продуцент" онкорнавируса типа с(тэк-мва-76) | 1978 |
|
SU702073A1 |
| СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ЛЕЙКОЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА | 2008 |
|
RU2377962C1 |
| Штамм культивируемых клеток почки эмбриона коровы для культивирования вируса лейкоза крупного рогатого скота | 1989 |
|
SU1652338A1 |
| ВАКЦИНА АССОЦИИРОВАННАЯ ПРОТИВ АДЕНОВИРУСНОЙ, ГЕРПЕСВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИЕЙ, ПАРАГРИППА-3 И ВИРУСНОЙ ДИАРЕИ-БОЛЕЗНИ СЛИЗИСТЫХ ОБОЛОЧЕК КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА ИНАКТИВИРОВАННАЯ ЭМУЛЬСИОННАЯ | 2012 |
|
RU2517733C1 |
| Вакцина ассоциированная против парагриппа-3, инфекционного ринотрахеита, вирусной диареи, рота- и коронавирусной инфекций крупного рогатого скота инактивированная эмульсионная | 2018 |
|
RU2696007C1 |
| ВАКЦИНА ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ ХЛАМИДИОЗА СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ И ПУШНЫХ ЗВЕРЕЙ | 1995 |
|
RU2085213C1 |
| ВАКЦИНА АССОЦИИРОВАННАЯ ПРОТИВ ПАРВОВИРУСНОЙ, РЕОВИРУСНОЙ, ГЕРПЕСВИРУСНОЙ ТИПА I ИНФЕКЦИЙ И ВИРУСНОЙ ДИАРЕИ - БОЛЕЗНИ СЛИЗИСТЫХ ОБОЛОЧЕК КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА ИНАКТИВИРОВАННАЯ ЭМУЛЬСИОННАЯ | 2010 |
|
RU2452512C2 |
| ШТАММ ДИПЛОИДНЫХ КЛЕТОК ЛЕГКОГО ПЛОДА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА ДЛЯ РЕПРОДУКЦИИ ВИРУСОВ | 2012 |
|
RU2515915C1 |
| СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ЛЕЙКОЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА | 2016 |
|
RU2620558C1 |
Использование: биотехнология, вирусология, ветеринария. Сущность изобретения: линию клеток легкого эмбриона коровы, хронически инфицированную вирусом лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС), получают путем сокультивирования клеток легкого эмбриона коровы с лейкоцитами инфицированной ВЛКРС и большой лейкозом коровы. Клеточная обозначена ЛЭК- ВИЭВ-90 и депонирована под номером ВСКК (СХК) 1. Линия клеток репродуцируется на отечественных средах с добавлением коммерческой сыворотки крупного рог атого скота. „ч
