Клеточная линия тимуса эмбриона крупного рогатого скота мва-76 "продуцент" онкорнавируса типа с(тэк-мва-76) Советский патент 1979 года по МПК C12K9/00 

крупного рогатого скота, полученная в США октором Ван дер Маатеном 5.

Эти длительно пассируемые фибробластоподобные клетки продуцируют онкорнавирус. и онко1энавирусные антигены и используются ляШкопления и концентрации вируса и антигенов с целью изучения их свойств и использования в серологических реакциях.

Однакоэти длительно пассируемые клетки не являются перевиваемой линией и, следовательно, не мОгут размножаться неопрееленно долго, и в процессе старения обречёны на вырождение, кроме того, они заражены штаммом онкорнавируса, выделенным в США ОТМестного крупного рогатого скота, больного лейкозом, что ограничивает возможности исследования этих клеток Для изучения вирусологических аспектов лейкоза стране. Клетки селезенки плода выращиваются на питательной среде, содержащей 20°/о сыворотки плода коровы, оторая не выпускается в промьтщленных масштабах в нашей стране.

Целью изобретения является линия перевиваемых клеток, хронически инфицированная отечественным штаммом онкорнавируса крупного рогатого скота, интенсивно проуцирующая онкорнавирус и онкорнавирусный антиген и обладающая способностью хорошо репродуцироваться на отечественной питательной среде с коммерческой сывороткой крупного рогатого скота, служащая наежньш источником онкорнавируса и онкорнавирусного антигена для изучения вирусоогических аспектов лейкозов крупного рогатого скота.

На рис. 1 представлена электронная микрофотография клеток линии МВА-76; на рис. 2 - микрофотография вирусных частиц типа С.

Клеточная линия тимуса эмбриона коровьи МВА-76, инфицированная отечественным штаммом онкорнавируса крупного рогатого скота, продуцирующая как онкорнавирус, так и растворимые онкорнавирусные антигены, имеет следующие морфологические и физиологическиехарактёристи ки

Клетки МВА-76 растут на поверхности стекла в виде однослойной культуры. По морфологии клетки культуры МВА-76 однородны и имеют фибробластоподобную форму с круглым или овальным ядром, содержащим 1 -Ч ядрыщка округлой формы.

Пример. Клетки культивируются in vitro при 37°С в питательной среде, состоящей из среды Игла и 10% сыворотки крупного рогатого; скота.

Оптимальная плотность посадки составляет 15 X 10 клеток в 1 мл среды. Монослой формируется на 5 суток. В прЪцессе созревания культуры происходит nocteneHное закйслёние среды. С поверхностей стекла клетки хорошо снимаются подогретым до 37°С 0,02/о-ным раствором Версена. Клетки

702073

обладают хорошей адгезивной способностью, пересеиваются 1 раз в неделю. Коэффициент пересева равен 1 : 3 - 1 : 4. Линия клеток не контаминирована микОплазмами и цитопатогенными вирусами.

Линия перевиваемых клеток тимуса эмбриона коровь1 МВА-76, хронически инфицированная онкорнавирусом крупного рогатого скота, получена путем сокультирования клеток тимуса эмбриона коровы на 4 пассаже с лейкоцитами крови лейкозной. коровы, инфицированной онкорнавирусом крупного рогатого скота. В процессе пассажей (на уровне 30. пассажа) морфология клеток стабилизировалась. Клетки имеют фибропластоподобную форму (рис. 1) и продуцируют

В,питательную среду онкорнавирус крупного рогатого скота и вирус -.индуцированный антиген. Продуцируемый клетками онкорнавирус идентичен Исходному вирусу, использованному для заражения клеток, имеет под электронньш микроскопом типичную для

вирусных Частиц типа С морфологию - центрально расположенный электронноплотный нуклеотид отдельный от двухслойной оболочки просветом. Размер нуклеотида составляет 60 - 80 нм, а всей вирусной частицы 120 нм (рис. 2). Продукция онкорнавирусного антигена этой культурой выявляется с помощью реакции иммунодиффузии в агаровом геле с использованием тест-системы для идентификации онкорнавирусных антигенов (сыворотка крупного рогатого

скота, содержащая антитела к гликопротеидному антигену вирусной обо;|0чки и онкорнавирусный гликопротеидный антиген). Технико-экономическая или иная эффективность.

Клеточная линия тимуса эмбриона коровы МВА-76 - продуцент онкорнавируса крупного рогатого скота интенсивно продуцирует онкорнавирус и онкорнавирусные антигены. Продукция вируса..в.этой клеточной системе значительно более высокая, чем в краткосрочных культурах лейкоцитов лейкозных животных. Нативная культуральная жидкость шестисуточной культуры клеток МВА-76 может быть использована в реакции связывания комплемента в качестве антигена для йыявления онкорнавирусных антите.л у инфицированных животных. В отличие

от краткосрочных культур перевиваемые

клетки .МВА-76, продуцируя вирус, не разрушаются и не загрязняют клеточными обломками вирусный материал, что существенно облегчает процесс концентрации и очистки вируса и вирусных антигенов.

Преимуществом перевиваемой - - линии клеток МВА-76 является то, что она хронически инфицирована отечественным штаммом онкорнавируса к культивируется на оте-чественной питательной среде с сывороткой крупного рогатого скота. Код1центрация жидкой фазы культуры клеток лцн.ии МВА-76 позволяет получать онкорнавирусные антигены, используемые в реакции иммунодиффузии в агаровом геле для выявления животных носителей- онкорнавирусной инфекции и для эпизоотологической оценки хозяйств по лейкозу круаного рогатого скота. Перевиваемая линия .клеток MjBA-76 мо: жет быть использована .для биофабричного производства онкорнавирусных антигенов. Формула изобретения Клеточная линия тимуса крупного рогатого скота МВА-76-продуцент онкорнавируса типа С (ТЭК-МВА-76)-хранится в коллекции Московской ордена Трудового Красного Знамени ветеринарной академии имени К. И. Скрябина. Морфологические признаки. Фибропластрподобные, отросчатые вытянутой формы клетки. Ядро овальной или округлой формы расположено эксцентрично. В популяции преобладают клетки с гетероплоидным набором хромосом. Физиологические признаки. Клетки культуры растут в виде монослоя в среде Игла с добавлением 10% сыворотки крупного рогатого скота, не содержащей антител к онкорнавирусу крупного рогатого скота. Оптимальная плотность посева составляет 15 X 10клеток/мл. Монослой формируется на 4 - 5 сутки. С поверхности стекла снимаются 0,02% раствором Версена. Индекс щосева составляет 1:3. Дополнительные признаки. Линия хро.нически инфицирована онкорнавирусом ца G, в цитоплазме клеток и в м ежклеточнрм пространстве образуются вирусные частицы типа С с,центрально расположенными элёктронноплотным нуклеотидом, отделенным от двухслойной оболочки просветом. Размер нуклеоида составляет 60 - 80 нм, а всей вирусной частицы 120 нм. Клетки продуцируют в питательную среду полный вирус, а также вирусиндуцированные, антигены, выявляемые в реакции связывания комплемента и реакции иммунодиффузии в агаровом геле. Интенсивная продукция вируса и вирусных антигенов позволяет использовать нативную культуральную жидкость в качестве антигена для РСК и реакции иммунодиффузии в агаровом геле с целью выявления животных вирусоносителей и эпизоотологической оценки хозяйств по лейкозу.. Источники информации, принятые во внимание при экспертизе 1.Шишков В. П., Кукайн Р. А.-Н., Нагаева Л. И., Крикун В. А., Кумков В. Т., Иткин Б. 3., Брацлавская О. И. и Лебедева Т. В. Выделение онкорнавируса типа С (штамм ЛЛ МВА-1) от крупного рогатого скота с персистентным лимфоцитозом. Доклады ВАСХНИЛ 1977, 5, 20. 2.I. М. Miller, С. Olson, I. Nat. Cancer Inst. 1972, 49, 1459-1462. a.l. F. Ferrer, NV I).Stok. P. Lin, I. Nat. Cancer Inst: 1971: 47, 613 - 621. 4.Авторское свидетельство СССР № 578338, кл. С 12 К 9/00, 1977. 5.М. I. Van der Maaten, I. М. Miller, A. D. Boothe, I. Nat. Cancer Inst. 1974, 52,491 --497 (прототип).

Фиг.2 . V.,-.