ШТАММ ДИПЛОИДНЫХ КЛЕТОК ЛЕГКОГО ПЛОДА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА ДЛЯ РЕПРОДУКЦИИ ВИРУСОВ Российский патент 2014 года по МПК C12N5/73 C12N7/00 

Предлагаемое изобретение относится к области ветеринарной биотехнологии и вирусологии, в частности получению нового штамма клеток из легкого плода крупного рогатого скота «ЛПК», отвечающего требованиям биобезопасности и чувствительного к широкому спектру вирусов.

В клетках животного происхождения в процессе длительного культивирования происходят кариологические, культурально-морфологические изменения, которые могут приводить к изменению чувствительности их к вирусам. При этом возможна их контаминация латентными вирусами, микоплазмами и др. микроорганизмами, что создает угрозу для биобезопасности в производстве биопрепаратов, а также непредсказуемым результатам при проведении вирусологических исследований. В связи с этим получение новых клеточных штаммов, свободных от контаминантов и чувствительных к возбудителям вирусных болезней, является актуальным.

Известен штамм гетероплоидных клеток почки теленка Таурус-1, чувствительный к вирусам гриппа А, аденовирусам человека и крупного рогатого скота, инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота. Штамм представлен клетками эпителиоподобного типа, поддерживается на среде Игла MEM с 10% сыворотки крупного рогатого скота (1).

Известен также штамм культивируемых клеток легких плода коровы для культивирования вирусов (ЛЭК). Монослой формируется клетками эпителиоподобного типа в течение 3-4 сут. на среде Игла MEM с 10% сыворотки. Культура клеток ЛЭК обеспечивает репродукцию вирусов ИРТ, ПГ-3, PC крупного рогатого скота. Инфекционный титр этих возбудителей достигает на этой культуре 10⁵-10⁶ТЦД₅₀/мл.

В процессе длительного культивирования штамм ЛЭК контаминировался вирусом ВД-БС и M.arginini (2). Прототип.

В задачу наших исследований входило получение нового, свободного от контаминации, чувствительного к вирусам крупного рогатого скота штамма клеток легкого плода коровы, применяемого для диагностики вирусных инфекций и накопления вирусного материала.

Предложенный штамм обладает следующими свойствами.

Морфологические признаки. Клеточный пласт ЛПК на 3-4 сут. культивирования состоит из тесно прилегающих друг к другу полигональных клеток с четко выраженными границами. В популяции преобладают клетки фибробластоподобного типа. Ядра клеток крупные, овальной или округлой формы с одним или двумя ядрышками. Большинство ядер содержат мелкосетчатый хроматин. Цитоплазма гомогенная, в отдельных клетках встречаются вакуоли, расположенные, в основном, возле ядра. Некоторые клетки (1%) содержат по два ядра.

Кариологические признаки. Штамм ЛПК является диплоидным. Модальное число хромосом 58-60 (85%), интервал изменчивости 56-62.

Молекулярно-генетические признаки. В полимеразной цепной реакции (ПЦР) с видоспецифическими праймерами, комплементарными к участку генома, кодирующего субъединицу b цитохром оксидазы, подтверждено происхождение штамма от крупного рогатого скота. Штамм свободен от вирусов диареи - болезни слизистых оболочек, лейкоза крупного рогатого скота, микоплазм, что подтверждено методом ПЦР.

В цитологических препаратах и при бактериологическом исследовании не выявлено контаминации бактериями, грибами, простейшими.

Культуральные свойства. Штамм ЛПК поддерживают на среде, состоящей из ГЛА и Игла MEM 1: 1 с 10% фетальной сыворотки крупного рогатого скота. Культуру клеток выращивают при температуре 36,5-37°C. Кратность рассева 1: 2 - 1: 3. Срок формирования монослоя 3-4 сут.

Получение штамма. Предложенный штамм ЛПК получали следующим образом. Легкое плода коровы подвергали дезагрегации с использованием 0,125%-ного раствора трипсина в нескольких циклах. Диспергированные клетки объединяли, центрифугировали при 1000 об/мин, определяли жизнеспособность, ресуспендировали в ростовой среде (ГЛА в смеси с Игла MEM и 10% сыворотки плодов коров) и засевали в культуральные флаконы. На 5-е сутки после образования монослоя проводили субкультивирование с кратностью рассева 1:2-1:3. Последующие пассажи проводили через 3-4 суток на среде того же состава. Отделение клеток от стекла осуществляли смесью версена с трипсином в соотношении 9:1. Клетки криоконсервировали с использованием 10% ДМСО, 40% фетальной сыворотки и 50% питательной среды. Концентрация клеток составляла 3-4 млн клеток в 1 мл. Жизнеспособность после восстановления - 85-90%.

Пример 1. Культивирование вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота (ИРТ)

В культуру клеток ЛПК со сформированным монослоем вносили вирус ИРТ в количестве 0,01-1 ТЦД50/мл. Адсорбцию вируса проводили в течение 1 часа при температуре 37°C. Затем инокулум удаляли, а в культуру вносили поддерживающую среду, состоящую из ГЛА и Игла MEM 1:1. Инфицированную культуру инкубируют при температуре 37°C в течение 1-3 сут, ежедневно оценивая изменения в монослое. ЦПД проявлялось через 18-30 часов. Полное разрушение монослоя наблюдали через 30-72 часа в зависимости от заражающей дозы и штамма вируса. Уровень накопления вируса определяли по его инфекционному титру в стандартной культуре клеток почки теленка ПТ и параллельно в культуре клеток ЛПК. Максимальный титр вируса ИРТ, репродуцированного в культуре клеток ЛПК, составлял 10⁶-10^6,75ТЦД₅₀/мл. Культура клеток ЛПК проявляла чувствительность ко всем испытанным штаммам вируса (ТК-А(ВИЭВ)В₂, ТНЛ, К-40).

Уровень репродукции вируса свидетельствовал о высокой чувствительности культуры клеток ЛПК.

Пример 2. Культивирование штамма ПТК 45/86 вируса парагриппа-3 крупного рогатого скота (ПГ-3)

В культуру клеток ЛПК со сформированным монослоем вносили вирус ПГ-3 в количестве 0,1-1 ТЦД₅₀/мл. Адсорбцию вируса проводили в течение 1 часа. Инокулум удаляли, в инфицированную культуру вносили поддерживающую среду и культивировали при температуре 37°C в течение 3-5 сут. Первые признаки ЦПД - формирование симпластов, удлинение клеток, образование пустот - наблюдали через 48 часов, максимальное ЦПД - через 72 часа после заражения. Инфекционный титр вируса достигал максимальных значений - 10⁶-10⁷ ТЦД₅₀/мл по ЦПД или 10^6,3-10^7,5 по гемадсорбции эритроцитов морской свинки.

Уровень репродукции вируса ПГ-3 свидетельствовал о высокой чувствительности культуры клеток ЛПК к этому возбудителю.

Пример 3. Культивирование вируса диареи - болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота (ВД-БС)

В культуру клеток ЛПК со сформированным монослоем вносили вирус ВД-БС (штаммы ВК-1B 1 №28 и Орегон) в количестве 0,1-0,5 ТЦД₅₀/мл. Адсорбцию вируса проводили в течение 1 часа. Инокулум удаляли, в инфицированную культуру вносили поддерживающую среду и культивировали при температуре 37°C в течение 3-5 сут. Первые признаки ЦПД - образование отдельных участков округлых пикнотических клеток - наблюдали через 48 часов после заражения. Выраженное ЦПД (большинство клеток монослоя представлено мелкими пикнотическими клетками, которые быстро отслаивались от стекла) регистрировали через 72-96 часов после заражения. Инфекционный титр вируса достигал максимальных значений -10^5,5-10^6,0ТЦД₅₀/мл.

Пример 4. Определение титра антител к вирусу ИРТ в сыворотке крови крупного рогатого скота в реакции нейтрализации

Уровень антител против вируса ИРТ в положительной и отрицательной сыворотке определяли в реакции нейтрализации. Для этого делали двукратные серийные разведения сыворотки, в которые добавляли по 100 ТЦД₅₀/мл вируса. Суспезию клеток ЛПК с концентрацией 150-200 тыс. клеток/мл с 10% фетальной сыворотки разливали в лунки культуральных планшетов, содержавших смесь разведений сыворотки и 100 ТЦД₅₀/лунку вируса. Учет реакции проводили через 48 часов культивирования в СО₂ инкубаторе при температуре 37°C. Титр антител составлял 1:32 для положительной и 0 для отрицательной сыворотки, что соответствовало титру антител, выявляемому в других культурах клеток.

Культура клеток ЛПК, как видно из примера, пригодна для определения титра антител в реакции нейтрализации.

Пример 5. Выделение вируса ИРТ из назальных мазков больного крупного рогатого скота

В пробирки со сформированным монослоем клеток ЛПК (а также MDBK - контроль) вносили назальную слизь, разведенную культуральной средой Игла MEM 1:10. После адсорбции в течение 1 часа клетки трижды промывали и инкубировали со средой без сыворотки при температуре 37°C в течение 5 суток. ЦПД, характерное для вируса ИРТ, проявлялось уже в первом пассаже, в то время как в процессе трех слепых пассажей в культуре клеток MDBK присутствия вируса не выявили.

Культура ЛПК является пригодной для вирусовыделения.

Как видно из приведенных примеров, штамм является новым, свободным от контаминации вирусами, микоплазмами, бактериями, грибами, клетками других видов животных. Он представляет собой биобезопасный субстрат для культивирования вирусов, обеспечивающий высокий уровень их репродукции. Культура клеток штамма ЛПК пригодна для диагностики вирусных инфекций, в частности выделения вирусов из патологического материала и индикации противовирусных антител в реакции нейтрализации.

Штамм апробирован с положительным результатом в отделах клеточной биотехнологии и вирусологии ГНУ ВИЭВ Россельхозакадемии в 2011-2012 гг.

Штамм хранится в специализированной коллекции перевиваемых соматических клеточных культур сельскохозяйственных и промысловых животных РККК (П) (СХЖ РАСХН) под №83.

Предложенный штамм клеток легкого плода коровы найдет применение в научно-исследовательских учреждениях, диагностических лабораториях, биологической промышленности.

Просим предложенный штамм, согласно документации, назвать «ЛПК».

Источники информации

1. Патент РФ №1347448, Кл. C12N 5/06, 27.09.1985 г.

2. А.С. СССР №1306121, Кл. C12N 5/06, 22.12.1986 г.

Изобретение относится к области ветеринарной биотехнологии и вирусологии и касается штамма диплоидных клеток легкого плода крупного рогатого скота. Охарактеризованный штамм выделен из легкого плода коровы и депонирован в Специализированной Коллекции перевиваемых соматических клеточных культур сельскохозяйственных и промысловых животных РККК(П) (СХЖ РАСХН) при Всероссийском научно-исследовательском институте экспериментальной ветеринарии им. Я.Р.Коваленко (ВИЭВ) под №83. Штамм культивируется на среде Игла MEM и ГЛА 1:1 с 10% сыворотки плода крупного рогатого скота, свободен от вирусной, микоплазменной и бактериальной контаминации. Штамм может быть применен для накопления вирусов и достоверной диагностики вирусных инфекций.

Штамм диплоидных клеток легкого плода крупного рогатого скота для репродукции вирусов, депонированный в Специализированной Коллекции перевиваемых соматических клеточных культур сельскохозяйственных и промысловых животных РККК(П) (СХЖ РАСХН) при Всероссийском научно-исследовательском институте экспериментальной ветеринарии им. Я.Р.Коваленко (ВИЭВ) под №83.