Способ получения N-ацильных производных пептидогликанового мономера или их фармацевтических солей Советский патент 1992 года по МПК C07K9/00 A61K37/02 

мунологической активностью, малотоксичных с более высокой степенью липофильно- сти.

Поставленная ц ель достигается описываемым способом получения М-ацильных производных пептидогликанового мономера общей формулы I сн2он

NHOCCHj/ NHOCCH, / снз

CHjCHCONHCHCONHCHCOMH2

VCH2

СН2CHj СН3

CO-NHCHCONHCHCONHCHCOOH

но

сн,он

«Г -бн

1

фг, снг сн,

RHN-CH-CONH2

где R - ацидильная группа;

Са - Cis - алкилкарбоновой кислоты с прямой цепью;

Сз- а/усилкарбоновой кислоты с разветвленной цепью,

Cie - алкенилкарбоновой кислоты,

С ароматической карбоновой кислоты или их фармацевтически приемлемых солей,

заключающимся в том, что пептидолглика- новый маномер формулы II

О

СН2ОН

-О - Г-0

сн,он

J-0 Ъ ОН

NHOCCH

NHOCCH,

сн,

CHjCHCONHCHCONHCHCONH

г.

/снг снгсн3 сн3

CO-NHCHCONHCHCONHCHCOOH :СНг

снг снг

. H-HN-CH-CONHZ

вводят во взаимодействие с ангидридом или сложным эфиром кислоты формулы 111

R -ОН,

где значения R указаны выше. Процесс ведут в присутствии основания и целевой-про- даукт выделяют в свободном виде или в виде его фармацевтически приемлемых солей.

За ходом реакции следят с помощью тонко-слойнои хроматографии (ТСХ) на матрице из силикагнеля в качестве адсорбента, и в системе растворителя, которая является

подходящей для разделения продуктов от исходных реагентов, такой как система растворителя н-пропанол-вода 7:3 (объем/объем) (система А).

Продукт получают после добавления органического растворителя, в котором он не растворим, такого как этилацетат (ЕтОАс). Его чистят с помощью обычных методов, таких, как хроматография на колонке на раз0 личных адсорбентах, например, силикагеле, при элюировании названной выше системой А, или на Сефадексе при элюировании водой.

Изобретение иллюстрируется следую5 щими примерами.

П р и м е р 1. Получение N а-соли N-аце- тил-P GM.

В раствор PGM (500 г, 0,495 м моля) в воде (7 мл) добавляют насыщенный водный

0 раствор бикарбоната натрия (№НСОз, 2,75 мл) и раствор охлаждают на ледяной бане при 5°С. В охлажденную смесь добавляют по каплям ангидрид уксусной кислоты (2,75 мл, 29 ммолей) и все перемешивают 24 ч при

5 20°С. Смесь затем концентрируют с помощью выпаривания при пониженном давлении, давая маслянистый осадок (0,95 г), который растворяют в воде (2.5 мл) и разделяют на колонке, заполненной 150 мл Сефа0 деке G-25 тонко-дисперсная, после чего элюируют водой. Продукты, включающие фракции, объединяют и лиофилизируют, Выход 490 мг(92%)..Т.пл. 186 - 188°С, УФмакс. (вода) (нм) : 202, ИККВг () : 3400 - 3240,

5 1660, 1550, 1410.

1Н ЯМР (Д20) (млн.дол.): 1.90 (с..ЗН СНзСОМН-А2Рт), 1,96 (с., ЗН, СНзСО H-CIc), 2.03 (с., ЗН, С НзСОМН-Mur). Сокращения: А2рт-диаминопиметил

0 Mur-мурамоил

Glc-глкжозаминил

П р и м е р 2. Получение М-стеароил- РСМ.

В раствор PGM (1.546 мг, 1,53 ммоля) в

5 ДМФ (26.6 мл) добавляют сукциниимидо- стеарат (800 мг, 2.09 ммоля) и триэтиламин (TEA) (0,4 мл, 2,18 ммоля), и смесь перемешивают 20 ч при 20 - 25°С. Получают жела- тинообразную суспензию, в которую

0 добавляют по каплям при перемешивании ЕтОАс(180мл), и перемешивание продолжают еще в течение 5 ч. Осадок отделяют с помощью фильтрования и сушат. Выход 2 г. Продукт очищают с помощью хроматогра55 фии на колонке на силикагеле (26 г) и при элюировании системой растворителя А. Фракции, включающие продукт, объединяют и концентрируют с помощью выпаривания растворителя при пониженном давлении Выход 1,44 г (57%). Т.пл. 217 220°С, УФмакс (вода)(нм): 204; ИККВг (см 1): 3280,2910,2350, 1635, 1530.

П р и м. е р 3. Получение N-пивалоил- PGM. .

В раствор PGM (500 мг, 0,495 ммоля) в ДМФ (10 мл) добавлялся сукцинимидо-пи- валат (137 мг, 0,688 ммоля) и триэтиламин (TEA) (0,13 мл, 0,7 ммоля), и смесь перемешивают в течение 24 ч при 25°С. В прозрачный раствор добавляют по каплям ЕЮАс (50 мл) и получающийся осадок хранят при перемешивании в течение 2 ч и отфильтровывают. Осадок промывают этилацетатом (2 х 5 мл) и сушат. Выход: 550 мг. Продукт очищают с помощью колонной хроматографии на силикагеле и при элюировании системой растворителя А. Фракции, включающие продукт, объединяют и концентрируют с помощью выпаривания растворителя при пониженном давлении. Выход 270 мг (49,8%). Т.пл. 202 - 204°С, УФмакс (вода) (нм): 201;

-1

(см 1): 3400, 3300, 3080, 3050, 2980, 1650, 1540.

П р и м е р 4. Получение М-оленоил-PGM.

В раствор PGM (500 мг, 0,495 ммоля) в ДМФ (9 мл) добавляют сукцинимидо-олеат (258 мл, 0,679 ммоля) и триэтиламин (TEA) (0,13 мл, 0,7 ммоля), и смесь перемешивают в течение 24 ч при 25°С. Добавляют по каплям этилацетат (50 мл), и получающийся осадок хранят при перемешивании в течение 3 ч. Осадок отделяют фильтрованием и сушат. Выход 680 мг. Осадок чистят с помощью колонной хроматографии на силикагеле, элюирования системой растворителей А. Фракции, включающие продукт, объединяют и концентрируют с помощью выпарива- ния растворителя при пониженном давлении. Выход 0,345 г (54,6%). Т.пл. 204 - 206°С, УФмакс. (вода) (нм): 198; ИККВг (см 1): 3300, 2950, 2875, 1640, 1555.

П р и м е р 5. Получение М-бензоил-PGM.

В раствор PGM (1,346 мг, 1,33 ммоля) в ДМФ (23,3 мл) добавляютсукцинимидо-бен- зоат (400 мг, 1,825 ммоля) и триэтиламин (TEA) (0,35 мл), и смесь перемешивают 24 ч при 25°С. Добавляют по каплям этилацетат (160 мл) и полученную суспензию выдерживают при перемешивании 5 ч. Осадок отде- ляют фильтрованием, промывают этилацетатом (2 х 10 мл) и сушат. Выход 1,45 г. Продукт чистят с помощью хроматографии на колонке на силикагеле при элюировании системой растворителя А. Фракции, включающие продукт, объединяют и концентрируют с помощью выпаривания растворителя при пониженном давлении. Выход 1,04 г (69,1%) Т.пл. 173 - 175°С, УФмакс .(вода) (нм): 203, 224 (плечо); ИКкВг (см 1) 3260, 1680, 1515.

Примерыб-9. Аналогичным образом, как описано в примерах 2-5, получают следующие PGM производные: кзприлоиль- ное, лауроильное и пальмитоильное. Оенов- 5 ные физические характеристики указанных производных представлены в табл.1.

П р и м е р 10. Получение N-стеароил- PGM.

В раствор стеариновой кислоты (284,5

0 мг, 1 ммоль) в смеси растворителей этилаце- тат-тетрагидрофуран (1:1, объем/объем, 25 мл) добавляют N-гидрокси-бензотиазол (HOBt) (162.2 мг, 1,2 ммоля) и ДСС (247 мг, 1,2 ммоля), и смесь перемешивают 16ч при

5 20 - 25°С. Полученный осадок отделяют с помощью фильтрования и промывают на фильтре этилацетатом (2x3 мл). Маточную жидкость и экстракты объединяют и выпаривают досуха при пониженном давлении

0 Нечищенный продукт (470 мл) чистят с помощью хроматографии на колонке на силикагеле (5 г) с элюированием системой растворителя хлороформ-метанол (100 : 1, объем/объем). Получают 350 мл очищенного

5 N-бензтриазол-стеарата, который растворяют в ДМФ (20 мл), добавляют PGM (511 мг, 0,499 ммоля) и триэтиламин (TEA) (0,13 мл), и смесь перемешивают 16 ч при 20 - 25°С. Получают желатинообразный осадок, к ко0 торому добавляют этилацетат (88 мл), и пе- ремешивание продолжают в течение дополнительного часа. Осадок отделяют фильтрованием, повторно суспендируют в этилацетате (45 мл), перемешивают 1 ч и

5 еще раз отфильтровывают и сушат. Выход 621 мг. Продукты чистят с помощью5 хроматографии на колонке на силикагеле (8 г) при элюировании системой растворителя А. Фракции, содержащие продукт, объединя0 ют, растворитель выпаривают при пониженном давлени, и продукт сушат. Выход 542.5 мг(85%). Продукт был индентичен продукту примера 2.

П р и м е р 11. Получение натриевой соли

5 М-стеароил-PGM.

N-стеароил-РСМ Примера 2 (1.276.5 мг, 1 ммоль) добавляют к воде (20 мл), где растворено эквимолярное количество гидроокиси натрия. Чистый раствор переме0 шивают в течение 1 ч и лиофилизуют. Выход 1,281 мг.

Пример12. Получение натриевой соли М-стеароил-Р6М. ,

Согласно процессу примера 2 неочи5 щенный продукт, полученный после осаждения с помощью добавления этилацетата, суспендируют в воде, нейтрализуют добавлением гидроокиси натрия до рН 7, после чего прозрачный раствор выливают в колонку, заполненную Sephadex G-25 fine, после

чего осуществляют элюирование водой, Фракции, включающие индентичный продукт, как в примере 11, объединяют и лио- филизируют

Аналогичным образом, как описано в примерах 11 и 12, получают дополнительные фармацевтически приемлемые соли

Биологическая активность М-ацилпро- мзводных PGM,

Эффект N-ацилпроизводных PGM был исследован на иммунологическую активность. Применялись два иммунологических метода. Один относится к гуморальной, а другой к клеточной иммунной реактивности. Гуморальная имунная реактивность была выражена модификацией технологически клеткообразуемых плашек Jerhe и др (2),

Замедленный гип гиперчувстпительно- сти использовался как метод выражения клеточного иммунного ответа (2).

Для эксперимента использовались мышь-самец, линии СВА/1, 6-8 недельного возраста. В каждую экспериментальную группу включалось 5-8 мышей.

Отрицательной контрольной группе вводили обычный соляной раствор.

Положительная контрольная группа получает МДР. Все активные вещества дают в эквимолярных концентрациях, обеспечивающих 100 мг МДР на мышь. Результаты выражают как абсолютное число PFC на мышь для гуморальной и отек задней лапы в мм х 0,1 для клеточной имуннореактивно- сти.

Для статического анализа используют t-тест Student, потому, что незначительные отклонения от нормального распределения были найдены тестом Смирнова-Холмогорова. Уровень Р 0,05 рассматривался значительным. Значимость различий оценивалась с помощью двойного испытания при уровне приемлемости, равном или менее 5%. Суммированные результаты действий индивидуальных N-ацильных производных на параметры иммунной ответной реакции приведены в табл.2 и на чертеже.

Статически значимое увеличение веса селезенки было обнаружено после применение натриевой соли М-стеароил-PGM и натриевой соли М-олеоил-PGIVt (13% и 21 % соответственно по сравнению с контрольными значениями). Относительное увеличение веса селезенки было также найдено после использования Na-соли М-бензоил- PGM, Na-соли М-лауроил-PGM и Na-соли N- гшвалоил-PGM различия по отношению к контрольным величинам не значительно увеличивались, хотя имела место отчетливо выраженная тенденция улучшенной активности указанных производных. Изменения

числа лимфоцитов селезенки (абсолютное число в 1 мл) отличались для каждого производного. В группе мышей, которые получали Na-соли N-лауроил-РСМ; наблюдалось статистически значимое уменьшение в 20% по сравнению с контрольными величинами. У мышей, которым давали Na-соль G-каприло- ил-PGM, имело место статистически значимое увеличение числа лимфоцитов

0 селезенки (19%). Уменшение 4-6% числа лимфоцитов селезенки было обнаружено у мышей после назначения им пивалоильных и ацетильных производных, тогда как увеличение 3 - 9% было найдено у мышей, кото5 рым давали олеоильное,-каприноильное и пальмитоиль.ное производное PGM. Хотя имела место явно определенная тенденция в достигнутых изменениях, последние не представляли статическую значимость. Ни0 какого эффекта на число лимфоцитов селе- ззнки не было со стороны Na-солей стеароильных и бензоильных производных PGM. фактически все проверенные вещества обнаружили увеличение PFC,-которое

5 варьировало в пределах 10 - 66% по сравнению с контрольными величинами. Статистически значимая разница, однако, была обнаружена только в случае Na-солей N- бензоил, N-лауроил и N-папьмитоил прриз0 водных PGM. Все использованные вещества усиливали активность PFC, о чем свидетельствовали данные по отношению к числу лимфоцитов селезенки, .1 которые варьировали в пределах 9 - 75% по сравне5 нию с величинами, обнаруженными в контрольной группе мышей. Статистически значимое различие было найдено для лауро- ильного производного PGM. Ясно выраженная усиливающаяся тенденция была

0 обнаружена в случае бензоильного и ацетильного производных PGM, когда различия по сравнению с контрольными значениями практически достигали статистически значимого уровня (0,5 р 0,1).

5На основании полученных результатов

можно сделать вывод, что все проверенные N-ацильные производные пептидогликано- вого мономера проявляют определенную иммуностимулирующую активность, и тем

0 не менее индивидуальные производные отличаются по их эффективности. Одна из воз- можных интерпретаций разнообразия получающихся различий в числе лимфоцитов и увеличении веса селезенки могла бы

5 заключаться в различных механизмах активности PGM и его заявленных N-ацильных производных в отношении клеточной имун- ной системы. Другой возможной причиной мог бы быть тот факт, что они сходны по механизму активности, и все же отличаются

по их внутренней (свойственный им) активности, Действие на гуморальный иммунитет очевидно на основании измерений активности PFC и отличается до некоторой степени от действия на число лимфицитов селезенки. Значительное влияние на общую активность PFC было обнаружено в случае бензоильного, лауроильного и пальмито- ильного производных PGM, что существенно не изменяет и не уменьшает число лимфицитов в 1 мг ткани селезенки.

Структурные модификации молекулы PGM привели в результате к новой и неочевидной биологической активности описыва- емых N-ацильных произвольных PGM. продемонстрированной двумя различными путями: значительное влияние на клеточную иммунную ответвую реакцию, характерное для лауроильного и каприлоильного произ- водного PGM; с другой стороны, бензоиль- ное, лауроильное и пальмитоильное производные PGM более значительно вовлечены были в гуморальный иммунитет. Полученные результаты продемонстирова- ли превосходящую активность соединений по изобретению вследствие их действия на клеточный и гуморальный иммунитет; кроме того, они показали лучшую активность по сравнению с исход- ными PGM, когда оно назначалось в той же концентрации При этом соединения по изобретению мало токсичны (от 1 - 5 г/кг) и обладает более высокой липо- фильностью.

Формула изобретения

Способ получения N-ацильных производных пептидогликанового мономера фор- 40 мулы

СН2ОНСНоОН

-ОL-0

он ЭГ-О- ОР -он

нг

с Ггсн, сн3

O-NHCHCONHCHCONHCHCOOH снг СНг ;

снг

RHN-CH-CONH.J

где R - ацильная группа С2 - Cia-алкилкар- боновой кислоты с прямой цепью;

Cs-алкилкарбоновой кислоты с разветвленной цепью, Cie-алкиенилкарбоновой кислоты;

С - ароматической карбоновой кислоты,

или их фармацевтически приемлемых солей, отличающийся тем, что, пепти- догликановый мономер формулы

CHjOH

NHOCCH,/ NHOCCH,

7

CHjCHCOMH- СНСОШСН2ОН

-О (.0 Х-ОН

-сн-сомнг

СН,

Ун,

сн,

, н

CO-NH-CHCONHCHCONHCHCOOH

;снг

«гс

т«

н-нм-сн-сошг

вводят во взаимодействие с ангидридом или сложным эфиром кислоты формулы R-OH, где значения R указаны выше, процесс ведут в присутствии основания и целевой продукт выделяют в свободном виде или в виде его фармацевтически приемлемых солей.

Таблица 1

ИСПОЛЬЗОЕ ание в биологии и медицине. Сущность изобретения получение М-ациИзобретение относится к способу получения новых биологических активных соединении - N-ацильных производных пептидогликанового мономера или их фармацевтически применяемых солей, которые могут найти применение в биологии и медицине. Известен мономер пептидогликана (PGM), обладающий им,муномодулирующей и актиметастатической активностью PGM - нетоксичное и апирогенное соединение, ходильных производных пептидогликанового мономера формулы I Ctfj СН) но H«jCСН2ОН |Hjr--0((n2v,OH /ф-WWCOWHCHCOVHCHCaW кноссн,/мсссн,,е ЈНнг 7CHJ и / / f 5CHCOWHCHCOWHCHCOC4, I,п..н % Ь RHtVtH-COV/h сн& С% где R - С2 - Cie ацил неразаветвленной кислоты, Cs разветсленной кислоты, Cis-ал- кенилкарбоновой кислоты, С ароматической карбоновой кислоты. Реагент 1. соединение I, где R - Н, реагент 2- ROH. Условия реакции: основание, продукты выделяют в свободном виде или в виде соли 2 та б л рошо растворимо в воде, но не растворимо в органических растворителях Благодаря высоко гидрофильной и липофобной природе оно не способно проникать через липо- фильные мембранв в организме Степень гидрофильности и липофильности таких соединений может значительно влиять на их активность. Цель изобретения - способ получения новых производных пептидогликанового маномера, обладающих более высокой имXJ Ч« Ю to сл 00 СА)

Основные физические характеристики N-каприлоил-, N-каприноил, N-лауроил и

N-пальмитоил-производных PGM

Иммунологические эффекты производных N-ацил PGM

Таблица 2