Способ диагностики туберкулеза Советский патент 1992 года по МПК G01N33/535 

Изобретение относится к области медицины и биологии, а именно, к способам определения микобактерий туберкулеза.

Прототипом данного метода является определение микобактерий в мокроте бактериоскопическим и бактериологическим методами.

Однако при массовом исследовании бактериоскопический метод дает только 40,60% положительных результатов, а результаты бактериологического исследования (посева) бывают положительными только у половины бопьных с положитепьным результатом бактериоскопии и лишь у 10-20% с отрицательным результатс)м. При этом положительные результаты посева удается получить в сроки от 2-Зх недель (50% среди положительных результатов посева) - до 2-х месяцев.

Целью изобретения является ускорение способа и повышение чувствительности диагностики туберкулеза.

Способ осуществляют следующим образом,

В среде для культивирования микобактерий методом непрямого твердофазного, иммуноферментного анализа (ИФА) в сроки 1-3 недели определяют антиген микобактерий с помощью моноклональных антител МТ-1 и антител из гипериммунных сывороТОК к микобактериям туберкулеза вида human штамма H37RV. В качестве диагностических препаратов используют моноклональные антитела к антигену микобактерий МТ-1 (регистрационный № 488 Д во Всесоюзном банке клеточных культур) л глобулиновую фракцию, полученную ocaждeн /ie i сульфатом аммония при 33% насыщении из гиперир1мунных сывороток к микобактериям туберкулеза штамма Н37Р. Для определения микобактерий туберкулеза мокроту после обработки в щелочной среде заливают в количестве 0,2 мл на плотную питательную среду с добавлением жидкой питательной среды Школьникова с 10%ным содержанием плазмы. Культуральную Ж1у1дкость исследуют, начиная с 1-ой недели. При постановке МФА на полистироловые планшеты наносят 25 мкл моноклональных антител MT-I в концентрации 100 мкг/мл, и /1нкубируют 1 ч в термостате при 37°С, затем от -1ывают трижды (50 мкл) забуфе)енн ы м ф и 3 и о л о г и ч е с к и м р а с т в о р о F.I с 0,05%-твина-20 (ЗФР-твин) и в течение 1 ч блокируют раствором ЗФР-твин с 0,5% бычьего сывороточного альбумина (ЗФРтвин-БСА), после отмывания ЗФР-твином (трижды по 50 мкл) в лунки наносят по 25 мкл культуральной жидкости, инкубируют в течение 1 ч при 37°С и после отмывания ЗФР-твином (трижды по 50 мкл) наносят по 25 мкл глобулиновой фракции кроличьей гипериммунной сыворотки к микобактериям губеркулеза вида hurnanus, штамма Н37Р. После инкубации в течение 1 часа в термостате и отмывания ЗФР-твином (трижды по 50 мкл наносят по 25 мкл антител, против глобулинов кролика, и меченных пероксидазой хрена и истощенных на глобулинах мыши. После инкубации в течение часа в термостате и отмывания ЗФР-твином (трижды по 50 мкл) реакцию проявляют добавлением субстрата - 25 мкл ортофеН1илендиамина с перекисью водорода в цитратно-фосфатном буфере рН 5,0. Реакцию останавливают добавлением 25 мкл 1,25 Н серной кислоты. Реакцию оценивают спектрометрически при длине волны 492 нм.

Пример 1. Производят забор мокроты и посев ее. Начиная с 1-ой недели, исследуiOT Культуральную жидкость на наличие микобактерий туберкулеза, сравнивая с отрицательным и положительным контролем. В качестве отрицательного контроля используют Культуральную жидкость после посева

мокроты от больного хроническим бронхитом, в качестве положительного - стандарт спец ально отобранную Культуральную жидкость после посева мокроты от больного туберкулезом легких. Превышение уровня

иммуноферментной реакции на 0,2 единицы оптической плотности и больше, чем в отрицательном контроле, свидетельствует о положительной реакции. Использование положительного контроля необходимо для

проверки точности проведения реакции.

Так, было обследовано 64 больных туберкулезом легких (инфильтративный и очаговый, впервые выявленный) - окончательный диагноз был установлен на основе

комплекса клинико-лабораторных признаков и результатов лечения. Результаты сопоставления бактериологического и иммунологического исследований представлены в таблице.

Таким образом, предложенным способом было выявлено 49 случаев туберкулеза из 64-х, причем в срок 2 недели у 50% больных, по сравнению с 23% больных, выявленных бактериологическим методом. У

больных хроническим бронхитом микобактерии в мокроте обнаружены не были.

Сопоставление результатов определения микобактерий микробиологическим и иммуноферментным методами (исследованы культуры от 64 больных) приведено в таблице.

Формула изобретения Способ диагностики туберкулеза, включающий забор крови, высев ее на селективную среду, инкубирование с последующим выявлением бактерий туберкулеза, о т л и ч а ю, щ и и с я тем, что, с целью повышения чувствительности способа и сокращения времени диагностики, после инкубирования

производят смыв, выявляют в нем антигены бактерий туберкулеза иммуноферментным методом с фиксированными на твердой подложке моноклональными антителами типа МГ-1 с вторичными антителами из гипериммунной сыворотки к микобактериям туберкулеза H37RV и при наличии антигена диагностируют туберкулез.

Изобретение относится к области медицины и биологии, а именно к способам определения микобактерий туберкулеза. Целью изобретения является ускорение способа и повышение чувствительности диагностики. В среде для культивирования микобактерий после посева мокроты, методом непрямого иммуноферментного анализа в сроки 1-3 недели определяют антигены микобактерий туберкулеза с помощью моно- клональных антител МГ-1 и антител из ги- периммуных сывороток к микобактериям туберкуле за штамма H37RV, Для этого на полистироловые 96-луночные планшеты наносят моноклональные антитела, затем смыв с питательной среды, на которую была посеяна мокрота больного, затем антитела из гипериммунной сыворотки к микобактериям туберкулеза, реакцию проявляют антителами против глобулинов кролика, меченными пероксидазой хрена и истощенными на глобулинах мыши! После добавления ортофенилендиамина с перекисью водорода измеряют оптическую плотность окрашенного раствора при длине волны 492 нм. Превышение оптической плотности на 0.2 единицы и больше по сравнению с контролем считают положительной реакцией. По сравнению с прототипом сокращаются сроки диагностики туберкулеза в среднем в 2 раза, 1 табл.