Способ оценки селекционного материала кукурузы на выявление гена Опейк-2 Советский патент 1989 года по МПК A01H1/06 

ж

Изобретение относится к биотехнологии ,в частности, к селекционно-генетическим исследованиям сельскохозяйственных культур, и может быть широко применено при массовой оценке селекционного материала на наличие мутантного гена Опейк-2. Целью изобретения является повышение точности диагностики, а также обеспечение сохранности зернового селекционного материала. Способ заключается в том, что ген Опейк-2 выявляют по пониженной активности аспартатаминотрансферазы в листьях, отобранных после опыления, причем экстракцию альбумина проводят после удаления из образца хлорофилла. 4 табл.

Изобретение относится к биотехноЧ логии, в частности к селекционно- генетическим исследованиям сельскохозяйственных культур, и может быть применено при массовой оценке селекционного материала на наличие мутант- ного гена Опейк-2.

Цель изобретения - повьппение точности диагностики и сохранение зернового селекционного материала.

Способ состоит в том, что ген Опейк-2 выявляют по понизанной активности аспартатаминотрансферазы в листьях, отобранных после опыпення, причем экстракцию.альбумина проводят после удаления из образца хлорофилла.

В табл. 1 приведены данные по опг ределению активности аспартатамино

-

,

трансферазы в белковом экстракте листьев исходной и мутанной кукурузы без предварительной экстракции хлорофилла; в табл. 2 - данные по определению активности АСТ-азы в белковых экстрактах листьев исходной и мутантной кукурузы линий wf 9 по фазам созревания зерна после удаления из листьев хлорофилла; в табл. 3 - данные по определению активности АСТ-азы в белковых экстрактах листьев исходной и мутантной кукурузы ли- ний А 204 по фазам созревания зерна в разные годы полевого опыта.

Способ осуществляют следующим образом.

Навеску размолотых свежих или лио- фштьно высушенных листьев заливают охлажденным ацетоном в соотношении

|

ю

Is 10 и вьщерживают в течение 30 мин. Пробы центрифугируют. Супернатант отбрасьтают. Операцию проводят дважды. Из осадка выделяют экстракт белков дистиллированной водой при Экстракт отделяют от механических примесей центрифугированием, В пробирки вносят по 1 мл предварительно приготовленного субстрата ACT и 0,2 мл кукурузного экстракта. Пробы инкубируют при З7 с 60 мин, добавляют 1 мл 1 мМ 2,4-динитрофенидгидра- зина, через 10 мин - 10 мл 0,4 М

15

20

25

30

NaOH и оставляют на 10 мин, затем измеряют оптическую плотность опытного образца на фотокалориметре или спектрофотометре при длине волны 500-560 нм. Контрольный образец об- рабатывают аналогично опытному, од- нако экстракт из зерна кукзфузы добавляют после инкубации. Определение активности АСТ-азы проводят параллельно в исходной и мутантной форме кукурузы. По пониженной активности аспартатаминотрансферазы судят о наличии гена Опейк-2 в генотипе кукурузы.

Субстрат для определения активности АСТ-азы готовят следующим образом.

30 г oi -кетоглутаровой кислоты и 2,7 г DL-аспарагиновой кислоты растворяют в 1 н, растворе NaOH до рН 7,4, затем 0,1 М фосфатным ром рН 7,4 доводят объем раствора убстрата до 100 мл. Хранят в замо роженном виде

Дня построения калибровочной кривой навеску 10 мл натрия 40 растворяют в 100 мл дистиллированной воды, В пробирки наливают соответственно по 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5 и 0,6 МП стандартного раствора и добавляют в Них дистиллированную воду 45 до 0,6 мл, что соответствует 10; 20; 30; 40;.50 и 60 мкг пирувата натрия в каждой пробе. Затем в пробирки добавляют 0,5 мл 2,4-динитрофенш1Гид35

55

Разина и через 10 мин 5 мл 0,4 М NaOH, По истечений 10 мин измеряют оптическую плотность проб при 500- 560 нм. Контроль содержит 0,6 мл воды вместо пирувата натрия.

Для оценки селекционного материала анализируют листья исходных и мутантных линий кукурузы.

Пример 1. 1г листьев кукурузы измельчают и заливают 5 мл ди5

0

5

0

05

5

0

.сткллированной воды при , Экстракцию белков проводят в течение 1 ч. Экстракт отделяют центрифугированием, J В пробирки вносят по 1 мл субстрата ACT и 0,2 МП экстракта листьев и проводят определение активности АСТ-азы

Различия в активности АСТ-азы между исходной и мутантной 0 ЗОЙ нивелируются за счет того, что на окраску проб, обусловленную активностью фермента, влияет окраска экстракта листьев в связи с присутствием хлорофилла.

Пример 2, 1 г листьев кукурузы +++wf 9 и 0,0,2.0,2. wf 9, отобранных в разные фазы развития, измельчают, заливают охлажденным ацетоном в соотношении 1:10 и выдержи- вают в течение 30 мин. Пробы центрифугируют, супернатант отбрасывают, Операцию проводят дважды, К осадку добавляют 5 мл дистиллированной воды при 0-4 С, Экстракцию белков проводят в течение 1 ч. Экстракт отде- ляю:Т центрифугированием, В пробирки вносят по 1 мл субстрата ACT и 0,2 мл экстракта листьев и проводят определение активности АСТ-азы,

Установлено, что введение мутант- ноге гена в генотрт линии wf9 вызва- ло снижение активности АСТ-азы в листьях. Активность АСТ-азы в листьях мутантной линии составляет 61-84% от активности фермента в листьях исходной формы кукурузы, что обусловлено более интенсивным оттоком АСТ-азы из листьев мутантной кукурузы в зерно, где ее активность повьппена по сравненшо с нормальным генотипом,

Пример 3, Обработку листьев проводят аналогично примеру 2 с линиями кукурузы А 204 и А 204, отобранных в разные фазы со-о зревания зерна в 1985 и в 1986 гг.

Активность фермента у мутантного генотипа во все сроки исследований составляет 63-83% по. отношению к ис- ХОДНСЙ4У. Абсолютные величины активности фермента изменяются в разнью фазы развития, а также зависят от погодных условий года проведения селекционно-генетических исследований. Однако срав1штельный анализ исходно- 5 го и мутантного генотипов линий А 204 в одни и те же фазы развития показывает сохранение установленной закономерности пониженной активности фермента в линии Опейк-2,

Пример 4. Обработку листьев проводят аналогично примеру 2 с линиями кукурузы +++ А 204; . А 204; +++wf9, отобранными в разные сроки вегетации 1986 г до опыления початков (см,табл,4).

Различия между исходной и мутант- ной кукурузой по активности аспар- татаминотрансферазы в листьях, отобранных до опыления предлагаемым способом, не вьгавлены. Установленная закономерность - пониженная активность АСТ-азы в листьях мутантной кукурузы - наблюдалась только в пробах, отобранных после опыления кукурузы, т.е. в период созревания зерна Очевидно, указанные различия по активности фермента в листьях, отобран- 20 отличающийся тем, что,

ньгх после опьшения, обусловлены различной спецификой динамики накопления белка в зерне мутантной кукурузы по отношению к исходной.

Предлагаемьй способ может найти широкое применение при проведении массовых селекционно-генетических исследований по созданию новых мутан

27,02 29,03

тов кукурузы с улучшенным качеством белка, а пониженная активность АСТ- азы в листьях может явиться одним из перспективных тестов при создании новых форм кукурузы.

Формула изобретения

Способ оценки селекционного материала кукурузы на выявление гена Опейк-2, предусматривакмций обработку размолотого растительного образг да экстрагентами с получением белковой фракции, включающий альбумин, очистку от механических примесей и последуищее выявление гена Опейк-2 по активности аспартатгминотрансфе- разы при длине волны 500-560 нм.

с целью повышения точности диагностики и сохранения селекционного зерно- вого материала, ген Опейк-2 выявляют по пониженной активности аспартат- 25 аминотрансферазы в листьях, отобранных после опьшения, причем экстракцию альбзгмина проводят после удаления из образца хлорофилла.

Таблица1

Таблица 2

5,53 7,71

80 75

Налив Молоч Молочно-восковая

Таблица 3