Способ дифференциальной диагностики системной красной волчанки и острого бактериального воспаления Советский патент 1993 года по МПК G01N33/80 

Изобретение относится к медицине, а именно к терапии, и может быть использовано для дифференциальной диагностики системной красной волчанки (СКВ) и острого бактериального воспаления (ОБВ).

В практике довольно часто возникает необходимость в дифференциальной диагностике аутоиммунного и острого бактериального воспаления. Речь идет прежде всего о синдроме лихорадки неясного гене- за и часто сочетающихся с ней общих симптомах слабости, недомогания, потери массы тела, воспалительных сдвигах в крови. Считают, что в основе синдрома чаще всего - в 75% случаев - оказывается большая тройка : инфекция (в 40% случаев), опухоли (в 20%), коллагено ы (15%), причем из кол- лагенозов на первом месте стоит СКВ (Бочо- ришвили В.Г, и соавт. Вести, хирургии. - 1989. - № 8, - С. 107-110). Довольно часто трудности диагностики усугубляются необходимостью быстрого выбора адекватной терапии; так, при одном из заболеваний большой тройки - молниеносном сепсисе - оптимальный срок постановки диагноза и назначения лечения - 8 ч, допустимый - 24 ч (Бочоришвили В.Г, и др. Вести,хирургии. - 1989. - № 8. - С. 107-110), при этом заболевание своевременно диагностируется лишь в 8,08% случаев.

Диагностический алгоритм при синдроме лихорадки неясного генеза предполагает следующий набор лабораторных исследований для исключения аутоиммунного заболе- л вания (СКВ) и острого бактериального воспаления. Методы объединены нами в две группы.о

В первую группу входят исследования общего анализа мочи с окраской осадка по Граму, общего анализа крови с подсчетом тромбоцитов, белковых фракций.

Во вторую группу входят посевы крови и мочи на стерильность, определение анти- нуклеарных факторов (АНФ), антител к на- тивной ДНК, поиски Le -клеток, биопсия поврежденных тканей.

Методы первой группы достаточно просты, общедоступны vi позволяют быстро

ел

С

х|

00

00

N

СЬ 00

получить результаты, однако они малоспецифичны. Так, лейкоцитоз считается характерным признаком бактериального воспаления, однако он обнаруживается лишь у 20% больных, почти так же часто - в 17,5 % случаев обнаруживается лейкопения, более характерная для СКВ. При сепсисе часто встречаются такие специфические для СКВ признаки, как анемия (в 68% случаев), лимфопения - в 87% случаев. В то же время при СКВ гематологический синдром, являющийся одним из диагностических критериев заболевания, обнаруживается у 59% больных, в частности, анемия - в 75% случаев, лейкопения - в 50% случаев, (чаще лимфопения, реже - гранулоцитопения), тромбо- цитбпения-лишь в 30% случаев, Ускорение СОЭ при СКВ отмечается в 100% случаев, при сепсисе в 87%.

Исследование мочи также малоспецифично; так, волчаночный нефрит диагностируется значительно чаще не с помощью клинических методов исследования, а с помощью исследования биоптата почек.

Данные, полученные с помощью электрофореза белков сыворотки крови, не вполне характерны гипер-у-глобулинемия появляется в основном при хроническом течении СКВ, гипер-«2 -глобулинемия возникает как при острой СКВ (или обострении хронической), так и при ОБВ (при сепсисе - в 84,5% случаев). « -глобулины, в том числе входящий в эту фракцию фибриноген, а также С-РБ - т.н. белки острой фазы - служат не для постановки диагноза, а для оценки тяжести патологического процесса (в т.ч. аутоиммунного и бактериального воспаления).

Методы, отнесенные к второй группе, являются специфичными и служат для подтверждения диагноза либо аутоиммунного, либо бактериального воспаления, однако и они обладают некоторыми недостатками. Так, специфичность их тоже не абсолютна. L Ј-клетки при СКВ даже высокой степени активности и при развернутой картине болезни обнаруживаются в 70-80% случаев, Тест на выявление АНФ обладает большей чувствительностью - 89%, однако специфичность умеренная - 78% (Клиническая иммунология и аллергология). АНФ обнаруживается у здоровых женщин, пожилых людей, появляются в крови при таких распространенных ситуациях, как прием антибиотиков; антиритмиков, противосудо- рожных и гипотензивных препаратов, причем появляются они и при атипично протекающем инфекционном процессе (Gale A. Me. Carty// Ann. Allergy. - 1985. - v.

55 - Ms 3. - P. 421-435). При использовании иммунофлуоресцентного метода доля лож- ноположительных результатов составляет 4% (там же). L Е -клетки по наиболее песси- 5 мистическим.заключениям обнаруживаются при 30 заболеваниях, в том числе не относящихся к аутоиммунным. Тест на определение антител к нативной ДНК наиболее специфичен для СКВ (98%), однако чувстви10 тельность его составляет всего 38%.

Методы исследования иммунологиче- ских показателей обладают еще одним недостатком - они трудоемки (исследование Ј -клеток, определение АНФ иммунофлуо15 ресцентным методом), дорогостоящи (РИМ), требуют специально оборудованных лабораторий и поэтому доступны только специализированным клиникам.

Посевы крови и мочи для определения

20 стерильности, сделанные однократно, могут дать положительные результаты при аутоиммунной патологии вследствие преходящих бактериемии и бактериурии. В то же время даже при явном сепсисе повторные

25 .трехкратные посевы крови - каждый посев в парные среды могут не выявить бактериемию в 30% случаев.

Существенным недостатком бактериологического исследования является и его

0 длительность - на него уходит от 4 до 20 дней, тогда как состояние больного часто требует немедленного вмешательства.

Для выполнения чрезвычайно информативного исследования - исследования био5 птата пораженных тканей -также требуется не менее 3-4 дней.

Таким образом, для дифференциальной диагностики СКВ и ОБВ применяются либо быстро выполнимые, доступные, однако, к

0 сожалению, малоспецифичные, либо высоко специфичные исследования, требующие однако значительных затрат времени, труда, атакжеспециальнооснащенныхлабора- торий, дорогостоящего оборудования и

5 реактивов.

Следует отметить также, что кроме случаев синдрома лихорадки неясного генеза необходимость в дифференциальной диагностике СКВ и ОВВ возникает при развитии

0 пневмонитов, а также абдоминального синдрома у больных с СКВ. Клиническая иммунология и аллергология. Под ред. Л.Йегера. - 1990). В последнем случае приходится решать трудный вопрос о наличии у больного

5 острой хирургической патологии.

Цель - создание метода дифференциальной диагностики СКВ и ОВВ, сравнимого по специфичности и чувствительности (и даже более чувствительного) с методами, обьединенными нами во вторую группу, и в то же время позволяющего быстро получить ответ и такого же дешевого, простого и общедоступного, как методы первой группы.

Поставленная цель достигается тем, что определяется состояние моноцитов периферической крови с помощью НСТ-теста в присутствии гепарина и в присутствии цитрата натрия и вычисляется соотношение долей (в %) НСТ-положительных клеток в гепаринзависимом (Г) и в цитратном (Ц) вариантах теста, при соотношении Г 4Ц - 33 предполагается СКВ, при соотношении Г 4Ц - 33 - острое бактериальное воспаление.

Техническое решение соответствует критерию положительный эффект, т.к. предлагаемый тест позволяет ускорить диагностику, при этом он при одинаковой специфичности более чувствителен, чем наиболее специфичный из используемых показателей.(наличие антител к нативной ДНК), в то же время простота и дешевизна метода делают его общедоступным.

В основе способа лежит методика по- становки НСТ-теста Park B.H. и соавт. в модификации М.Е.Виксмана и А.Н.Маян- ского (Виксман М.Е., Малнский А.Н. Способ оценки функциональной активности нейт- рофилов человека по реакции восстановле- ния нитросинего тетразолия. Внесены следующие изменения: тест ставится одновременно в двух вариантах - со стабилизацией крови раствором гепарина активностью 100 ед/мл и со стабилизацией крови 3,8%- ным раствором цитрата натрия; раствором гепарина обмываются микропипетки и лунки планшета, раствором цитрата натрия также обмываются микропипетки перед взятием крови, затем его добавляют в лунки планшета в соотношении с кровью 1:9;

в мазке крови вместо нейтрофилов подсчитывают количество НСТ-положительных моноцитов на 100 попавших в поле зрения моноцитов;

конечный результат определяется соотношением долей (в %) НСТ-положительных моноцитов в гепаринзависимом (Г) и цитратном (Ц) вариантах теста. Способ оценки результатов будет приведен ниже.

Перед взятием крови стенки микропипеток и лунки планшета для серологических реакций обрабатывают стабилизатором крови (цитрат натрия, гепарин). Палец обрабатывают смесью спирт-эфир и делают обычный прокол. Первую каплю крови удаляют, затем набирают в две микропипетки (цитратную и гепариновую) и вносят в соответствующие лунки по 0,05 мл крови. Добавляют 0,05 мл изотонического фосфатного

буфера и 0,05 мл 0,2% раствора НСТ. Плавными круговыми движениями кровь тщательно перемешивают, планшет покрывают фильтровальной бумагой, смоченной в фосфатном буфере, и сверху оргстеклом и ставят в термостат на 30 минут. После инкубации содержимое лунок вновь перемешивают и готовят мазки средней плотности, которые, высушив на воздухе, фиксируют 5 мин в метаноле и красят 7 мин метиловым зеленым. Учет результатов проводят как указано.

Воспаление аутоиммунной и бактериальной природы, как типовая патологическая реакция, развивается согласно определенным общим законам независимо от факторов, его вызвавших . Очерки патологии и экспериментальной терапии. - М., 1979). Этим объясняется наличие общих клинических и лабораторных признаков, обуславливающих необходимость дифференциальной диагностики двух видов воспаления. Однако, учитывая разницу в их патогенезе, можно предположить существование некоторых различий в функциональной активности клеток и систем организма при аутоиммунной и острой бактериальной патологии.

Так, в аутоиммунной и бактериальной воспалительных реакциях активно участвуют моноциты - макрофаги, однако характер участия этих-полифункцион альных клеток в развитии двух видов патологии различен.

При воспалении бактериальной природы мононуклеарные фагоциты прежде всего участвуют в фагоцитозе и переваривании микробов и продуктов распада тканей и лишь на более поздних этапах процесса взаимодействуют с лимфоцитами при выработке специфического ответа на чужеродный агент, а затем с фибробластами при формировании рубца.

При аутоиммунных заболеваниях ревматического круга ведущим является участие моноцитов - макрофагов в межклеточных взаимодействиях, приводящее к подавлению функции Т-супрессоров, активации В-лимфоцитов и Т-хелперов, избыточному синтезу коллагена фибробластами; причем эти процессы развиваются уже в самом начале болезни, иногда до появления клинических симптомов. Относительно меньшее значение имеет участие этих клеток в фагоцитозе, к тому же эти реакции носят более локальный характер.

С целью выявления различий в состоянии кислородного метаболизма моноцитов периферической крови при аутоиммунном и остром бактериальном воспалении нами исследовалась спонтанная НСТ-реакция клеток в цитратном и гепаринзависимом вариантах теста у 181 больной классическим ре- ыиатоидным артритом (РА), 8 больных системной склеродермией (ССД), 28 больных СКВ, 25 больных ОБВ. Контролем служили 23 донора и 10 больныхс деформирующим остеоартрозом, осложнившимся синовитом (ДОА).

Диагноз СКВ ставился в соответствии с критериями АРА (Насонова В.Н. Системная красная волчанка. - М,, 1972). В группу вошли 27 женщин и 1 мужчина с достоверной и вероятной СКВ с давностью болезни от недели до 20 лет. У мужчины диагноз подтвержден на вскрытии. У 20 (73,3%) человек болезнь носила первично-хронический характер, у 5 (16,7%) - подостры й, у 3 (10%) больных, начавшись остро, за время наблюдения под влиянием терапии приняла хроническое течение. В 9 случаях (33,3%) активность процесса соответствовала I степени, в 15 (53,4%) - II, в 4 (13,3%) - III степени. В группу больных с ОБВ вошли пациенты с сепсисом, острым пиелонефри- том, острой хирургической патологией, ос- ложнившейся перитонитом.

Для каждой из групп обследованных были сосчитаны выборочные средние (Мг и Мц) и стандартные отклонения (5ц и Sr) показателей активности моноцитов в гепарин- зависимом (Г) и цитратном (Ц) вариантах спонтанного НСТ-теста, а также выборочные коэффициенты корреляции (г) между значениями Г и Ц.

Обнаружилось, что, во-первых, гепарин активируют моноциты у всех обследованных, во-вторых, существует три вида реакции клеток: при обменно-дистрофическом процессе с реактивным воспалением (ДОА) в обоих вариантах теста их активность не отличается от нормальной (рг 0,05, рц 0,05); при ОБВ оба варианта теста свидетельствуют об активации мононуклеарных фагоцитов (рг 0,002, рц 0,002); при аутоиммунном воспалении избыточная актив- ность кислородного метаболизма моноцитов проявляется только в присутствии гепарина у больных РА (рг 0,002, Рц 0,05) и преимущественно при контакте с гепарином у больных с СКВ (рг 0,002, Рц 0,01) и с ССД (рг 0,002, рц 0,002). В последних двух группах активность клеток в цитратном тесте хотя и является достоверно более высокой, чем в норме, но фактически речь идет о разнице в 2-3 %, в то время как ошибка метода составляет 2%.

Таким образом, обнаружены существенные различия в состоянии кислородного метаболизма моноцитов больных с ОБВ и с аутоиммунной патологией. На основании

этих различий выработан критерий для дифференциальной диагностики ОБВ и СКВ.

Индивидуальные значения Г и Ц наносят на плоскость. По вертикальной оси откладывали значения Г, по горизонтальной - соответствующие им значения Ц. Приведены эллипсы рассеивания, отражающие местоположение индивидуальных показателей для двух групп (ОБВ, СКВ). Центральные точки эллипсов точки с координатами, равными средним значениям Г и Ц. Размеры и наклоны эллипсов отражают значения стандартных отклонений и коэффициентов корреляции. В дальнейшем характеристики, полученные в предположении, что показатели Г и Ц удовлетворяют двумерному нормальному распределению с параметрами, совпадающими с выборочными значениями, будем называть теоретическими, а найденные непосредственно по выборочным данным - эмпирическими. Отметим, что теоретические вероятности попадания значений Г и Ц в построенные эллипсы равны 86,5%.

Далее построили прямую, наилучшим образом разделяющую области, в которых сосредоточены показатели Г и Ц двух групп, - дискриминантную прямую. Она описывается уравнением Г 4Ц - 33. Диагностический критерий, основанный на прямой, состоит в следующем: если у больного для показателей Г и Ц выполнено условие Г 4Ц - 33, это свидетельствует в пользу СКВ, если Г 4Ц - 33, то - в пользу ОБВ.

Критерий обладает высокой специфичностью и чувствительностью при определении как ОБВ, так и СКВ, его информативность - 0,93.

Пример, Больная Герасименко,37лет, поступила в терапевтическую клинику ГИ- ДУВа в связи с ежедневными подъемами температуры до 38°С без ознобов, а также в связи с похуданием на 10 кг в течение месяца, арталгиями, выраженными миалгиями, множественными розеолезными высыпаниями до 5 мм на коже груди, спины, предплечий. Заболела за месяц до поступления в клинику после вторых нормальных родов. После первых родов 6 лет назад были артал- гии. Кроме указанных выше симптомов обнаружено увеличение подмышечных и паховых лимфоузлов, а также печени и селезенки. Лабораторные данные: Нв- 10,4 г/л, эритроциты - 3,28 1012 в 1 л, лейкоциты - 5,8 109 в 1 л, лейкоформу- ла: э - 0%, п/я - 16%, с/я - 60%, мои. - 8%, лимф. - 16%, СОЭ - 28 мм/ч, тромбоциты - 230400, формоловая проба отрицательная, ревматоидный фактор и Le -клетки не Обнаружены, протеинограмма без отклонений, в моче-0,33% белка. Посеяна кровь на стерильность. Гинеколог патологии не обнаружил.

Клиническая картина болезни не позволяла однозначно высказаться ни в пользу СКВ, ни в пользу сепсиса.

Спонтанный НСТ-тест: гепаринзависи- мый - 25% активных моноцитов, цитрат- ный - 22 %, т.е. Г 4Ц - 33, результаты теста свидетельствуют в пользу ОБВ. Проводившаяся ex juvamibus эффективная терапия антибиотиками и полученные позднее положительные результаты посева крови на стерильность подтвердили наличие сепсиса.

Таким образом, предлагается критерий для дифференциальной диагностики аутоиммунного (СКВ) и острого бактериального воспаления. Критерий основан на различиях в функциональном состоянии моноцитов, которые, вероятно, связаны с особенностями патогенеза этой универсальной патологической реакции, зависящими от причин ее возникновения.

По своей специфичности тест конкурирует и даже превосходит наиболее диагностически ценные лабораторные методы, применяемые для дифференциальной диагностики двух групп заболеваний (исследование биоптата пораженных тканей, посевы мочи и крови на стерильность, определение АНФ и антител к нативной ДНК). При этом для исследования биоптатов тканей, мочи и крови на стерильность требуется не менее 3-4 дней, для выполнения предлагаемого теста - 1-1,5 ч, что является его достоинством, так как состояние больного часто требует быстрого назначения адекватной терапии (иногда в течение 8-24 ч от начала

болезни). Исследования АНФ и антител к нативной ДНК проводятся в течение нескольких часов, однако их чувствительность ниже чувствительности предлагаемого теста (при СКВ АНФ находят в 89% случаев, антитела к нативной ДНК - в 38% случаев, чувствительность предлагаемого теста для ОБВ -96%, для СКВ -96,4%). Следует отметить также, что выполнение указанных методов требует специально оснащенных лабораторий, дорогостоящего оборудования и реактивов, специально обученных лаборантов. Для выполнения предлагаемого теста требуются термостат, световой михроскоп, доступные и дешевые реактивы (нит- росиний тетразолий производства НПКО Реакомплекс, г. Чита), тест может выполняться в условиях клинической лаборатории в любом неспециализированном медицинском учреждении.

Формула изобретения Способ дифференциальной диагностики системной красной волчанки и острого бактериального воспаления, включающий

морфологическое исследование крови, отличающийся тем, что, с целью ускорения и повышения точности способа, исследуют НСТ-реакцию моноцитов в гепаринизиро- ванной пробе крови и пробе цитратной крови, определяют уровень -в процентах НСТ-положительных клеток в п-ервом и втором вариантах теста и при условии Г 4Ц-33 диагностируют системную красную волчанку, а при условии Г 4Ц-33 - острое бактериальное воспаление, где Г - процент НСТ-положительных клеток в гепаринизи- рованной крови; Ц - то же в цитратной крови.

Использование: изобретение может быть использовано в терапии для дифференцирования системной красной волчанки и острого бактериального воспаления. Цель: ускорение и повышение точности способа. Сущность изобретения: у пациента исследуют НСТ-реакцию моноцитов крови при добавлении в нее гепарина и добавлении цитрата натрия и, сравнивая процентное содержание НСТ-положительных клеток в первом и втором вариантах проб, проводят диагностическое дифференцирование. Положительный эффект: на проведение теста требуется всего 1,0-1,5 ч, он является весьма специфическим и чувствительным.