СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ГОНОРЕИ Российский патент 1995 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к области медицинской диагностики инфекционных болезней и может быть применено в венерологии для диагностики гонореи.

Гонорея - инфекционное заболевание, передающееся преимущественно половым путем. Возбудитель - гонококк.

В соответствии с инструкцией по лечению и профилактике гонореи МЗ СССР 1988 года, диагноз гонореи больному может быть установлен только при лабораторном (бактериоскопическом или бактериологическом) обнаружении гонококков. При этом у значительного числа женщин (25-32%), больных гонореей, что подтверждено данными сексуального анамнеза, гонококк лабораторно не обнаруживается. В связи с этим значительное распространение получили отборочные тесты, позволяющие заподозрить гонорею, и при положительном результате подвергнуть больного углубленному обследованию.

Известно, что внедрение в кровь человека раздражителей, дестабилизирующих медиаторные системы плазмы, вызывает функциональную перестройку нейтрофилов. Активированные фагоциты можно отдифференцировать с помощью НСТ-теста, в котором под влиянием повышенного метаболизма лейкоцитов происходит трансформация бесцветного нитросинего тетразолия (НСТ-красителя) в восстановленную форму черных кристаллов формазана. Для выяснения резервных возможностей фагоцитоза применяют индуцированный НСТ-тест, вводя в систему препараты, с нейтрофилстимулирующими свойствами (Маянский А.Н., Маянский Д. Н. Очерки о нейтрофиле и макрофаге, Новосибирск, "Наука", Сибирское отделение, 1989, 344 с.).

Спонтанный НСТ-тест позволяет провести дифференциальную диагностику между бактериальными и небактериальными заболеваниям (Демин А.А., Дробышева В.П. Тер. Архив. - 1984, N 6, Т. LVI. - С. 144-147). Использование спонтанного теста для диагностики гонореи не представляется возможным из-за его низкой информативности. По авторским данным у практически здоровых показатели спонтанного НСТ-теста колеблются от 1 до 8% (в среднем - 3,29 ± 0,52%, у больных гонореей - от 1 до 27% (в среднем - 11,29 ± ± 2,13%). При этом у 42% больных гонореей значения НСТ-теста соответствуют таковым у здоровых и колеблются от 1 до 4%.

Использование индуцированного НСТ-теста с различными антигенами гонококка (гоновакциной, гонококковым аллергеном, живой культурой гонококка) показало, что наиболее высокую информативность имеет НСТ-тест с предварительной стимуляцией живой культурой гонококка (соответственно получены показатели 12,90± 1,39% ; 14,05± ± 2,08% и 27,47± 3,34%). Различия между показателями НСТ-теста со стимуляцией живой культурой гонококка и другими стимуляторами статистически достоверны, (Р₁ < 0,001; Р₂ < 0,001).

Целью изобретения является повышение в неясных случаях точности диагностики гонореи.

Поставленная цель достигается тем, что при постановке НСТ-теста дополнительно производится его стимуляция живой культурой гонококка, в концентрации 3 млрд.микробных тел в 1 мл изотонического раствора натрия хлорида в крови пациента, и при числе активированных нейтрофилов по отношению к общему количеству на 100 просмотренных (индуцированный НСТ-тест) выше 16%, диагностируют гонорею.

Постановка теста осуществляется следующим образом.

Суточные культуры 2-3 штаммов гонококков смываются изотоническим раствором натрия хлорида и концентрация микробных клеток доводится по эталону до 3 млрд.микробных тел.

Перед взятием крови больного стенки микропипеток и лунок пластин смачивают раствором гепарина в расчете 100 ед./мл.

В лунку пластины вносят 0,05 мл исследуемой крови, к которой добавляют 0,025 мл живой культуры гонококков и 0,025 мл 0,2%-ного раствора НСТ. НСТ готовят непосредственно перед употреблением следующим образом: к 2 мг НСТ добавляют 1 каплю (0,025-0,03 мл) 96^о-ного этилового спирта и 0,5 мл дистиллированной воды. После полного растворения НСТ добавляют 0,5 мл фосфатного буфера на двойном концентрате изотонического раствора натрия хлорида. Жидкость фильтруют через бумажный фильтр, предварительно смоченный фосфатным буфером.

Кровь с живой культурой гонококков и раствором НСТ тщательно перемешивают плавными круговыми движениями, лунку накрывают покровным стеклом, смоченным фосфатным буфером и помещают в термостат при температуре 37^оС на 30 мин. После инкубации содержимое лунки вновь перемешивают, после чего приготавливают мазок средней плотности, который высушивается на воздухе и фиксируется в 96^о-ном этиловом спирте в течение 5 мин. Затем мазок докрашивают 0,01%-ным раствором нейтрального красного в течение 7 мин, промывают дистиллированной водой, сушат на воздухе и микроскопируют под иммерсией.

Учет НСТ-теста: в мазке подсчитывают число нейтрофилов с темно-синими отложениями диформазана (восстановленная нерастворимая форма НСТ) по отношению к 100 просмотренным нейтрофилам.

НСТ-тест у лиц, не инфицированных гонококком, при стимуляции живой культурой гонококков колеблется от 2 до 16% (в среднем 9,14± 0,89%), у больных гонореей - от 15 до 63% (в среднем - 27,47±3,34%). Значения НСТ-теста выше 16% у практически здоровых не встречаются, у больных гонореей они составляют 79%, что позволяет использовать данный метод в качестве отборочного теста для диагностики гонореи.

П р и м е р 1. Больная Ухорцева Е.В., ист.болезни N 3316, 16 лет, госпитализирована в Нижегородский НИКВИ 11 декабря 1989 г. в связи с обнаружением гонококка в мазках из отделяемого мочеполовых органов в венерологическом диспансере, куда она обратилась по поводу жалоб.

При поступлении больная предъявляла жалобы на боли внизу живота и выделения из половых путей, появившиеся 4 месяца назад после случайной половой связи. Больная ведет беспорядочную половую жизнь, в связи с чем установить длительность заболевания не представляется возможным.

Данные клинического исследования: наружные половые органы сформированы правильно. Слизистая влагалища и шейки матки гиперемирована. Стенки уретры инфильтрированы. Свободных выделений нет, на ложке - серозно-мутные. Правая большая вестибулярная железа увеличена до горошины, после массажа ее получено гнойное отделяемое. Шейка матки эрозирована, из цервикального канала - слизисто-гнойные выделения. При двуручном гинекологическом исследовании патологические изменения не выявлены.

Проведено бактериоскопическое и культуральное исследование отделяемого уретры, влагалища, шейки матки, прямой кишки и правой большой вестибулярной железы на гонококк. Возбудитель гонореи обнаружен в мазках и посевах из отделяемого влагалища, правой большой вестибулярной железы и прямой кишки.

Больной поставлен диагноз хронической гонореи.

Для установления высокой специфичности предлагаемого НСТ-теста и возможности его использования для диагностики гонореи был определен НСТ-тест. Суточные культуры 3 штаммов гонококков были смыты изотоническим раствором натрия хлорида и концентрация микробных клеток доведена по эталону до 3 млрд.микробных тел.

Перед взятием крови больной стенки микропипеток и лунки пластины смочили раствором гепарина в расчете 100 ед./мл.

В лунку пластины внесли 0,05 мл крови больной, к которой добавили 0,025 мл живой культуры гонококков и 0,025 мл 0,2%-ного раствора НСТ, приготовленного непосредственно перед употреблением следующим образом: к 2 мг НСТ добавили 1 каплю (0,025-0,03 мл) 96^о-ного этилового спирта и 0,5 мл дистиллированной воды. После полного растворения НСТ добавили 0,5 мл фосфатного буфера на двойном концентрате изотонического раствора натрия хлорида. Жидкость профильтровали через бумажный фильтр, предварительно смоченный фосфатным буфером.

Кровь с живой культурой гонококков и раствором НСТ тщательно перемешивали плавными круговыми движениями, лунку пластины накрыли покровным стеклом, смоченным фосфатным буфером и поместили в термостат при температуре 37^оС на 30 мин. После инкубации содержимое лунки вновь перемешали, после чего приготовили мазок средней плотности, который высушили на воздухе и зафиксировали в 96^о-ном этиловом спирте в течение 5 мин. Затем мазок докрасили 0,01%-ным раствором нейтрального красного в течение 7 мин, промыли дистиллированной водой, высушили на воздухе и микроскопировали под иммерсией. В мазке подсчитали число нейтрофилов с темно-синими отложениями диформазана (восстановленная нерастворимая форма НСТ) по отношению к 100 просмотренным нейтрофилам. У данной больной он оказался равным 61%, что в 18 раз превышает значение спонтанного НСТ-теста у практически здоровых (3,29 ± 0,52%) и в 20 раз превышает значение спонтанного НСТ-теста у той же больной (3%).

П р и м е р 2. Больная Литяева Н.В., 17 лет, ист.болезни N 1525, госпитализирована в Нижегородский НИКВИ 15 июня 1990 г. как половой контакт больного гонореей.

При поступлении больная жалоб не предъявляла. Предполагаемая длительность заболевания 4 мес.

Данные клинического исследования: наружные половые органы сформированы правильно. Стенки уретры инфильтрированы, свободных выделений нет, на ложке - серозно-мутные, левая большая вестибулярная железа увеличена до размеров горошины, после массажа отделяемое не по- лучено.

Осмотр на зеркалах: шейка матки маленькая, коническая, обычной окраски. Вокруг цервикального канала - небольшая эрозия, из цервикального канала гнойные выделения. При двуручном гинекологическом исследовании патологические изменения не выявлены.

Проведено бактериоскопическое и культуральное исследование отделяемого уретры, цервикального канала и прямой кишки на гонококк. Гонококк обнаружен в посеве из отделяемого цервикального канала. Больному поставлен диагноз хронической гонореи. Для установления высокой специфичности предлагаемого НСТ-теста и возможности его использования для диагностики гонореи был определен НСТ-тест. Суточные культуры 3 штаммов гонококков были смыты изотоническим раствором натрия хлорита, и концентрация микробных клеток доведена по эталону до 3 млрд.микробных тел.

Перед взятием крови больной стенки микропипеток и лунки пластины смочили раствором гепарина в расчете 100 ед./мл.

В лунку пластины внесли 0,05 мл крови больной, к которой добавили 0,025 мл живой культуры гонококков и 0,025 мл 0,2%-ного раствора НСТ, приготовленного непосредственно перед употреблением следующим образом: к 2 мг НСТ добавили 1 каплю (0,025-0,03 мл) 96^о-ного этилового спирта и 0,5 мл дистиллированной воды. После полного растворения НСТ добавили 0,5 мл фосфатного буфера на двойном концентрате изотонического раствора натрия хлорида. Жидкость профильтровали через бумажный фильтр, предварительно смоченный фосфатным буфером.

Кровь с живой культурой гонококков и раствором НСТ тщательно перемешали плавными круговыми движениями, лунку пластины накрыли покровным стеклом, смоченным фосфатным буфером, и поместили в термостат при температуре 37^оС на 30 мин. После инкубации содержимое лунки вновь перемешали, после чего приготовили мазок средней плотности, который высушили на воздухе и зафиксировали в 96^о-ном этиловом спирте в течение 5 мин. Затем мазок докрасили 0,01% -ным раствором нейтрального красного в течение 7 мин, промыли дистиллированной водой, высушили на воздухе и микроскопировали под иммерсией. В мазке подсчитали число нейтрофилов с темно-синими отложениями диформазана (восстановленная нерастворимая форма НСТ) по отношению к 100 просмотренным нейтрофилам. У больной он оказался = 44%, что в 13 раз превышает значение спонтанного НСТ-теста у практически здоровых (3,29 0,52%) и в 22 раза превышает значение спонтанного НСТ-теста у той же больной (2%).

П р и м е р 3. Больная Зубова Е.Ю., 17 лет, ист.болезни N 1000, госпитализирована в Нижегородский НИКВИ 16 апреля 1990 г. как половой контакт больного гонореей.

При поступлении больная предъявляла жалобы на выделения из половых путей и дизурические расстройства. Предполагаемая продолжительность заболевания около 3 месяцев.

Данные клинического исследования: наружные половые органы сформированы правильно. Стенки уретры инфильтрированы, на ложке серозно-мутные выделения. Правая большая вестибулярная железа увеличена до размеров горошины, после массажа - выделения гнойные.

Осмотр на зеркалах: слизистая влагалища гиперемирована, вся поверхность шейки матки эрозирована, из цервикального канала - слизисто-гнойные выделения. При двуручном гинекологическом исследовании патологические изменения не выявлены. Произведено бактериоскопическое и культуральное исследование отделяемого уретры, шейки матки и прямой кишки на гонококк. Гонококк обнаружен в посеве из отделяемого цервикального канала. Больной поставлен диагноз хронической гонореи.

Для установления высокой специфичности предлагаемого НСТ-теста и возможности его использования для диагностики гонореи был определен НСТ-тест по предлагаемой методике. У данной больной он оказался равным 20%, что в 6 раз превышает значение спонтанного НСТ-теста у практически здоровых (3,29±0,52% ) и в 20 раз превышает значение спонтанного НСТ-теста у той же больной (1%).

П р и м е р 4. Больная Чернова Г.А., 17 лет, ист.болезни N 3347, госпитализирована в Нижегородской НИКВИ 14 декабря 1989 г. в связи с обнаружением гонококка в отделяемом половых органов в женской консультации, куда больная обратилась с подозрением на беременность. При поступлении больная предъявляла жалобы на боли внизу живота и выделения из половых органов. Больная ведет беспорядочную половую жизнь, в связи с чем установить длительность заболевания не представляется возможным.

Данные клинического исследования: наружные половые органы сформированы правильно. Стенки уретры инфильтрированы, свободных выделений нет, на ложке - серозные. Большие вестибулярные железы не пальпируются, после массажа отделяемое не получено.

Осмотр на зеркалах: шейка цилиндрической формы, цианотична. Вокруг цервикального канала небольшая эрозия, выделения из цервикального канала - слизистые. Матка увеличена до 7 недель беременности, мягковатая, безболезненная. Придатки не определяются, область их расположения безболезненна. Произведено бактериоскопическое и культуральное исследование отделяемого уретры, цервикального канала и прямой кишки на гонококк.

Гонококк обнаружен в мазках из отделяемого цервикального канала и прямой кишки.

Больной поставлен диагноз хронической гонореи.

Для установления высокой специфичности предлагаемого НСТ-теста и возможности его использования для диагностики гонореи был определен НСТ-тест. Суточные культуры 3 штаммов гонококков были смыты изотоническим раствором натрия хлорида и концентрация микробных клеток доведена по эталону до 3 млрд.микробных тел.

Перед взятием крови больной стенки микропипеток и лунки пластины смочили раствором гепарина в расчете 100 ед./мл.

В лунку пластины внесли 0,05 мл крови больной, к которой добавили 0,025 мл живой культуры гонококков и 0,025 мл 0,2%-ного раствора НСТ, приготовленного непосредственно перед употреблением следующим образом: к 2 мг НСТ добавили 1 каплю (0,025-0,03 мл) 96^о-ного этилового спирта и 0,5 мл дистиллированной воды. После полного растворения НСТ добавили 0,5 мл фосфатного буфера на двойном концентрате изотонического раствора натрия хлорида. Жидкость профильтровали через бумажный фильтр, предварительно смоченный фосфатным буфером.

Кровь с живой культурой гонококков и раствором НСТ тщательно перемешали плавными круговыми движениями, лунку пластины накрыли покровным стеклом, смоченным фосфатным буфером и поместили в термостат при температуре 37^оС на 30 мин. После инкубации содержимое лунки вновь перемешали, после чего приготовили мазок средней плотности, который высушили на воздухе и зафиксировали в 96^о-ном этиловом спирте в течение 5 мин. Затем мазок докрасили 0,01% -ным раствором нейтрального красного в течение 7 мин, промыли дистиллированной водой, высушили на воздухе и микроскопировали под иммерсией. В мазке подсчитали число нейтрофилов с темно-синими отложениями диформазана (восстановленная нерастворимая форма НСТ) по отношению к 100 просмотренным нейтрофилам. У данной больной он оказался равным 30%, что в 9 раз превышает значение спонтанного НСТ-теста у практически здоровых (3,29±0,52%) и в 20 раз превышает значение этого показателя у той же больной (1,5%).

Таким образом, на основании вышеизложенного и сравнения предлагаемого способа с базовым объектом можно сделать следующие выводы:
1. Авторами впервые предложен способ определения индуцированного НСТ-теста с использованием в качестве стимулятора живой культуры гонококка;
2. Авторами впервые показана возможность использования данного способа для диагностики гонореи в качестве отборочного теста.

3. Простота в исполнении и высокая специфичность результатов позволяют широко применять метод в амбулаторной практике, в частности при массовых обследованиях на гонорею.

Изобретение относится к области диагностики инфекционных болезней и может быть применено в венерологии для диагностики гонореи. Целью изобретения является упрощение и повышение информативности способа. Поставленная цель достигается тем, что проводится стимуляция НСТ-теста живой культурой гонококков, в концентрации 3 млрд. микробных тел в 1 мл изотонического раствора натрия хлорида, в крови пациента, и при числе активированных нейтрофилов по отношению к общему количеству на 100 просмотренных (индуцированный НСТ-тест) выше 16% диагностируют гонорею.

СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ГОНОРЕИ путем исследования крови больного, отличающийся тем, что, с целью упрощения и повышения информативности способа, к исследуемой крови добавляют живую культуру генококков в концентрации 3 · 10⁹ клеток/мл и нитросиний тетразолий в соотношении 2 : 1 : 1, инкубируют, делают мазок и окрашивают 0,01%-ным раствором нейтрального красного, далее подсчитывают количество нейтрофилов с отложениями диформазана и при количестве их выше 16% диагностируют гонорею.