Способ дифференциальной диагностики ревматоидного артрита и системной красной волчанки Советский патент 1993 года по МПК G01N33/533 

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии и ревматологии.

Известны способы дифференциальной диагностики ревматоидного артрита (РА) и системной красной волчанки (СКВ), заключающиеся в обнаружении в сыворотке крови ревматоидного фактора (РФ) и антинуклеар- ных факторов (АНФ).

Целью предлагаемого способа является повышение специфичности и чувствительности дифференциальной диагностики РА и СКВ. Для осуществления цели проводят определение реакции периферической крови к антигену хряща - лекарственному препарату румалон, представляющему собой хорошо стандартизированную смесь протеогликанов хряща, для чего производят

выделение лимфоцитов периферической крови, их инкубацию с румалоном (опыт) и без него (контроль), фиксацию клеток на предметном стекле и последующее определение уровня глобулинов (Г) в монослое, сравнение уровня глобулинов в пробах с выведением коэффициента по формуле:

К, / Гопыт - 1 х ЮО условных еди I контроль/ ниц (усл.ед.),

где Г - показатель уровня глобулинов, а Кг - коэффициент (показатель) антиген (румалон) зависимого синтеза глобулинов, и при коэффициенте больше 4 условных единиц реакцию считают положительной, а при ко00

го ел о о

31812500 4

эффициенте меньше 4 - реакцию считают(Г), синтезированных лимфоцитами перифе- отрицательной.рической крови, т.к. лифоидные клетки кро- Способ осуществляется следующим об-ви обладают способностью синтезировать разом. Лимфоциты выделяют из крови цен-иммуноглобулиыы. Сравнивая уровни глобу- трифугировэнием над сме.сью фиколгипак5 линов в опыте и контроле, рассчитываем 1,078 г/см3, однократно отмывают, ресус-коэффициент антиген (румалон) специфиче- пендируют в 0,5 мл физиологического рас-ски зависимого синтеза глобулинов (Кг) по твора (физ. р-ра). По 0,1 мл суспензии вносятформуле: в две центрифужные пробирки, в одну добавляют 0,02 мл разведенного в 2f раз ру-W „ / Гопыт 1 1ПП малона, в другую - 0,02 мл физ. р-ра. Пробы г Гконтроль Г инкубируют 18 часов при 37°С во влажной

камере, после инкубации во все пробы вно-Для доказательства специфичности опсят 0,02 мл, люминесцентной сывороткиределения глобулинов ставили модельные

против глобулинов человека (ФИТЦ - про-15 опыты, в которых к одинаковым пробам лимизводства ИИИЭМ им. Гамалея) в удвоен-фоцитов добавляли возрастающие количеном рабочем титре, пробы встряхивают,ства аутологической сыворотки,

инкубируют 1ч при комнатной температуре,Результаты представлены на чертеже,

затем центрифугируют 5 минут при 2000где показан график зависимости показателя

об./мин, надосадочную жидкость отбрасы-20 специфической флюоресценции (ПСФ) от

вают и осадок ресус пен диру ют в 1 каплеконцентрации сывороточных глобулинов

физ. , каплю суспензии из опыта и кон-(Гл). На графике видно, что при возрастании

троля переносят на предметное стекло, под-концентрации сывороточных глобулинов до

сушивают и определяют показатели25% (т.е. до разведения 1:4) возрастает и

специфической флюоресценции лимфоид-25 показатель специфической флюоресценции

ных клеток путем количественной цитофлю-(ПСФ), в то же время при дальнейшем возориметрии (КЦФ). КЦФ проводилирастении концентрации сывороточных глооригинальмым методом на базе микроскопабулинов ПСФ прогрессивно падает, что и

ЛЮМАМ-ИЗ, используя фотометрическуюдолжно иметь место при переходе реакции

приставку ФМЭЛ-1А. Цитофлюориметрию30 антиген-антитело в зону избытка антигена,

лимфоидных клеток осуществляли следую-Таким образом, ПСФ отражает уровень глощим образом: на произвольный участокбулинов в суспензии лимфоцитов, и может

препарата при невозбуждающем освеще-быть использован для количественных исснии фокусировали объектив фотометра, вледований.

котором был предварительно убран один из35 Основные сравнительные исследовамикрозондов с целью обеспечить измере-ния проводили в группах больных достоверния со всей площадки объектива. Измере-ным РА (24 человека) и достоверным СКВ (16

ния проводили в области 530 нм., выделяячеловек). Дифференциально-диагностичеее соответствующим интерференционнымскую специфичность и чувствительность

фильтром. После фокусирования невозбуж-40 способов при РА и СКВ определяли по налидающее освещение заменяли на возбужда-чию РФ в сыворотке крови методом латексющее и производили измерения суммарнойтеста (ЛТ), по наличию АНФ в сыворотке

флюоресценции (Ф). Затем сразу в том жекрови методом иммунофлюоресценции на

участке препарата измеряли интенсивностькриостатных срезах печени крыс (ИФМ) и по

светорассеивания клеток (С), используя для45 значению Кг в реакции глобулинпродукции

этого комбинацию невозбуждающих свето-лимфоцитов (РГПЛ). Результаты представфильтровМС-1 и НС-10. Суммарное свето-лены в табл. 1.

рассеивание (С) зависит от клеточнойКак видно из табл. 1, группа больных РА

плотности на площади препарата и отража-достоверно отличается от группы больных

ет количество анализируемых клеток. Таким50 СКВ по всем изучаемым показателям. Однаобразом, зная суммарную флюоресценциюко.еслидля РА (ЛТ - способ) и АНФ(ИФМклеток и их число, можно получить среднююспособ) эти различия в группах больных РА

величину флюоресценции на одну клетку ви СКВ носили однонаправленный характер

виде отношения: Ф/С х Т., где Ф - суммар-(для РФ существенное повышение, для

ная флюоресценция, С - суммарное свето-55 ифМ - существенное понижение), то в этих

рассеивание, Т - флюоресценция эталонагруппах больных средние значения показа(урановое стекло 2,3 мм). Данное соотноше-теля глобулинпродукции лимфоцитов в приние отражает среднее количество глобули-сутствии антигена хряща имели разную

нов, связанных с лимфоидными клетками,направленность: у больных РА - в сторону т.е. это есть показатель уровня глобулинов

повышения от 0 (+ 24,7 усл.ед.), а у больных СКВ - в сторону снижения от 0 (-12,9

усл.ед.).

Из данных табл. 2 следует, что чувствительность (точность) диагностики ЛТ-спосо- ба составляет для РА 57,5% (62,5%-5%) и для СКВ - 7,5%. Отсюда, при РА и СКВ дифференциально-диагностическая чувствительность (точность) ЛТ способа составляет 50%, соответственно ИФМ-способа - 62,5% и РГПЛ-способа - 81,5%. Значит, максимальная дифференциально-диагностическая чувствительность (точность) обнаруживается РГПЛ-способом и составляет 81,5% случаев, что на 19% превышает ИФМ-способом и на 31,5% - ЛТ-способом.

Также из данных табл, 2 видно, что наибольшей специфичностью обладает РГПЛ- способ, т.к. обнаруживается у 87,5% больных РА, в то время как ЛТ-способ - 62,5% больных РА, и ИФМ-способ - 75% больных СКВ, т.е. при проведении дифференциального диагноза межг.у РА и СКВ дифференциально-диагностическая специфичность РГПЛ-способа выше на 12,5% ИФМ способа и на 25% ЛТ-способа.

Как видно из табл. 3, при дифференциальном диагнозе между СКВ и РА с висцеритами, максимальная дифференциально-диагностическая чувствительность обнаруживается РГПЛ-способом и составляет 94%, что на 63% превышает ИФМ-способом и на 28,5% ЛТ-способом. Также из данных таблицы 3 следует, что диагностическая специфичность РГПЛ-способа составляет 100%, что выше на 25% ИФМ-способа и на 22% ЛТ- способа.

Приме р 1. Больная к 26 г поступила в клинику для уточнения диагноза. Жаловалась на боли в суставах, припухлость луче- запястных, правого голеностопного, левого локтевого суставов и проксимального меж- фалангового сустава III пальца правой кисти, утреннюю скованность в течение 30-40 минут, лихорадку до 37-37,5°С, эритему в области локтевых суставов, выпадение волос, похудение. Больна в течение 6 месяцев. В анализах крови: анемия, увеличение СОЭ. На основании клинико-лабораторных данных проводился дифференциальный диагноз между СКВ и РА. Рентгенограмма суставов: остеопороз, сужение суставной щели. РФ (ЛТ-способ) - отрицательный. АНФ (ИФМ-способ) - отрицательный. Кг (РГПЛ-способ) положительный +19 усл.ед. Наличие отрицательных значений РФ и АНФ в сыворотке крови не позволяет отличить РА от СКВ, т.е. эти показатели в данном случае не имеют дифференциально-диагностического значения, а наличие положительного значения Кг позволило выставить диагноз: Ревматоидный артрит Ы1 стадия, Пет.акт. При дальнейшем наблюдении, через 8 месяцев у больной 5 выявлены стойкие симметрические экс- судативно-пролиферативные изменения в проксимальных межфаланговых, пястно- фаланговых. лучезапястных и голеностопных суставах, ревматоидные узелки в

0 области локтевых суставов, амиотрофия межкостных мышц на тыле костей со стороны внутренних органов без патологии, в анализе крови - РФ положительный в разведении 1:320, рентгенологически - эрозии

5 хряща, что клинически лабораторно и рентгенологически подтверждает диагноз ре- вматоидного артрита.

П р и м е р 2. Больная М 21 года находилась в стационаре с жалобами на боли и

0 припухлость в голеностопном, правом луче- запястном, пястно-фаланговых и проксимальных межфаланговых суставах, лихорадку до 37,5°С - 38,6°С в течение 4 месяцев, боли в области сердца, эритема5 тозные высыпания на передней поверхности шеи. Больна в течение 5 месяцев. В анализах крови: анемия, лейкопения, увеличение СОЭ. Рентгенологически ;остеопороз, сужение суставной щели. Учитывая клиниче0 ские, лабораторные и рентгенологические данные, проводили дифференциальный диагноз между РА и СКВ. РФ (ЛТ-способ) - отрицательный, АНФ (ИФМ способ)- отрицательный, Кг (РГПЛ-способ) - отрицатель5 ный (22 усл.ед.). Как видно., значения вц данном случае РФ и АНФ не имеют дифференциально-диагностического значения, а отрицательное значение коэффициента позволило выставить диагноз: СКВ, подострое

0 течение, с поражением суставов, кожи, сердца. Через 2 недели припухлость суставов исчезла, В дальнейшем, через 6 месяцев при повторном поступлении у больной М, выявлена эритема в области лица по типу

5 бабочки, алопеция, потеря в весе до 8 кг. за 3 месяца, боли в суставах без выявлений дефигурации и деформации, одышка при ходьбе, в анализах крови - АНФ положительный в разведении 1:128, волчаночные

0 клетки, в анализах мочи -протеинурия до 1,0 г в сутки, на ЭКГ - диффузные изменения в миокарде левого желудочка, что клинически и лабораторно подтверждает диагноз системной красной волчанки.

5 Окончательный диагноз: СКВ, подострое течение, III ст. активности, с поражением кожи, сердца, почек, суставов, с общеатрофическими изменениями.

П р и м е р 3. Больная Ж. 36 лет находи- лась в клинике с жалобами на боли и припухлость в лучезапястных, пястно-фаланго- вых и проксимальных межфаланговых суставах, утреннюю скованность в течение 1 ч, лихорадку до , боли в области сердца, одышку при ходьбе, похудание на 5 кг в течение 2 месяцев, эритематозные высыпания на теле. Из анамнеза болеет в течение 9 месяцев. В анализах крови: анемия, резкое увеличение СОЭ. В анализах мочи: протеину- рия до 1,0 г в сутки. Рентгенологически: ос- теопороз, сужение суставной щели. Проводили дифференциальный диагноз между СКВ и РА с висцеритами. РФ (ЛТ- способ) - положительный 1:160 АНФ (ИФМ-способ) - положительный 1:32, Кг (РГПЛ-способ)- положительный +48 усл.ед. В данном случае положительные значения РФ и АНФ у одного и того же больного не позволяют провести дифференциацию между СКВ и РА с висцеритами, а наличие положительного значения коэффициента Кг позволило выставить диагноз РА с висцеритами, что в дальнейшем подтвердилось клинически, лабораторно и рентгенологически обнаружением у больной Ж, при повторном поступлении в клинику через 5 месяцев: клинически - полиартрита мелких суставов, локтевых, голеностопных и колейных суставов, симметричного характера, деформацией проксимальных суставов, ульнарной девиацией, атрофией межкостных мушц на тыле кистей: лабораторно: РФ + 1:640, АНФ 1:32: рентгенологически: множественных эрозий хряща, подвывихов пя- стно-фаланговых суставов.

Таким образом/предлагаемый способ отличается от аналога (ЛТ-способа) тем, что: а) Дифференциальная диагностика между РА и СКВ основывается на определений уровня гиперактивации В-иммунно- го ответа по отношению к антигену хряща (румалону), а не по уровню антител к гам- маглобулину. Поскольку использование в качестве атигена румалона органоспецифи- ческого стимула, который по логике формирования иммунного ответа при РА, имея отношение к специфической сущности ре- вматойдного артрита - эрозивному артриту, характеризует специфичность В-иммунного ответа именно при РА, а аггрегированный гамма-глобулин (реакция на него определяется в аналоге)- глобулин, представленный при любом иммунологическом процессе, включая пересадку органов, то отсюда становится ясно, что предложенный метод является более специфичным при РА, следовательно повышается дифференциально-диагностическая специфичность при

дифференциации РА и СКВ. б) Гиперактивация В-иммунного ответа определяется на клеточном уровне, а не на гуморальном уровне целого организма, что повышает

чувствительность дифференциального диагноза между болезнями, в) Дифференциально-диагностическая специфичность выше на 25%, а чувствительность выше на 31,5%. Предложенный способ отличается

от прототипа (ИФМ-способа) тем, что: а) Дифференциальный диагноз проводится путем определения уровня румалон-зави- симого синтеза глобулинов В-лимфоцита- ми, что характеризует специфичность

гиперактивацйи В-иммунного ответа при РА, а не по уровню сывороточных антител к компонентам ядер клеток (реакция на которых определяется в прототипе), которые обнаруживаются при других (кроме

СКВ и РА) заболеваниях с аутоиммунным патогенезом (системная склеродермия, лю- поидный гепатит и др). Отсюда, при применении предложенного способа повышается специфичность дифференциального диагноза между СКВ и РА. б) Дифференциация РА и СКВ проводится по значению коэффициента антиген зависимого уровня глобулинов, определяемЬго на клеточном уровне, а не по уровню антинуклеарных факторов,

определяемых на гуморальном уровне целого организма, что повышает чувствительность диагностики болезней, следовательно повышается дифференциально-диагностическая чувствительность, в)

Дифференциально-диагностическая специфичность выше на 12,5%, а чувствительность выше на t9,5%.

Формула изоб ре тения

Способ дифференциальной диагностики ревматоидного артрита и системной красной волчанки путем иммунологичеекого исследования крови, отличающий- с я тем, что, с целью повышения точности

способа, из исследуемой крови выделяют лимфоциты, инкубируют их с глюкозамин- глюкан-пептидным комплексом (Румалон Р) и вносят люминесцентную сыворотку против гамма-глобулина человека, далее

регистрируют уровень флюоресценции, рассчитывают коэффициент румалонзави- симого синтеза иммуноглобулинов и при положительном значении коэффициента равным 4 усл.ед. и более диагностируют

реематоидный артрит, а при отрицательном значении коэффициента менее 4 усл.ед. диагностируют системную красную волчанку.

Таблица 1

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии и ревматологии. Цель - повышение специфичности и чувствительности дифференциальной диагностики ревматоидного артрита w системной красной волчанки. Сущность - определяет уровень иммуноглобулинов, связанных с лимфой дными клетками, путем обработки клеток антисывороткой к иммуноглобулинам человека, меченой флюоресцеинизотиоциа- натом, далее регистрируют уровень флюоресценции и рассчитывают коэффициент по формуле: / 1 Хю0усл.ед, I контроль/ где к - коэффициент антиген (румалон) зависимого синтеза иммуноглобулинов, Гопыт показатель уровня иммуноглобулинов в присутствии румалона, Гконтроль - показатель исходного уровня иммуноглобулинов без румалона, и при положительном значении коэффициента (4 усл.ед. и более) диагностируют ревматоидный артрит, а при отрицательном значении коэффициента (менее 4 усл. ед.) диагностируют системную, красную волчанку. 3 табл. ел

Показатели ЛА, ИФМ, РГПЛ в обследованных группах

Таблица2 Частота положительных результатов ЛТ, ИФМ и РГПЛ в обследованных группах

Примечание: значение положительных результатов ЛТ и ИМФ-способов соответствует тем стандартам, которые приняты в клинической практике в нашей стране, а РГПЛ-спо- соба определяли в группе здоровых лиц, для чего находили максимальное значение- доверительного интервала по формуле: oWc М ± 2 а, {где М - среднее значение показателя РГПЛ, а о- среднее квадратичное отклонение) и которое равнялось 2,1 усл.ед. Отсюда, положительным результатом считали показатель, превышающий (еще в 2 раза -для большей точности} эти значения у здоровых, т.е. 4 усл.ед., а отрицательным - при коэффициенте меньше 4,

ТаблицаЗ.

Частота положительных результатов ЛТ, ИФМ и РГПЛ в группах больных СКВ и РА с висцеритом