Штамм бактерий ERWINIa SтеWаRтII для получения стимулятора роста растений Советский патент 1993 года по МПК C05F11/08 C12N1/20 

Изобретение относится к области сельскохозяйственной микробиологии и касается штамма, который продуцирует ростактивирующие вещества, и может быть использован для стимуляции роста растений с целью повышения урожайности.

В сельскохозяйственном производстве используют в качестве регуляторов роста растений витамины, аминокислоты, органические кислоты, ауксины, в частности, индо- лилуксусную(ИУК), индолилмасляную(ИМК) кислоты и гибберелины, а также другие биологически активные вещества. Однако, недостатком многих из этих препаратов

является то, что они дороги, требуют специального производства и иногда вызывают нежелательный побочный эффект. Природный ауксин-ИУК-оказался не очень пригодным для практических целей из-за его относительной нестабильности и быстрого распада в организме растения. Что касается гибберелинов, то их стимулирующее действие очень специфично и зависит от вида растений, кроме того, они часто оказывают ингибирующее влияние на развитие корневой системы растений.

В последнее время больше внимания уделяется биологическим способам стиму ч|СО 00

о

СЛ

го

W

ляции растений, менее вредным для здоровья человека и более безопасным в экологическом отношении. С этой целью используют разные микроорганизмы, продуцирующие ростактивирующие вещества.

Известен способ предпосевной обработки семян путем замачивания их в водной суспензии клеток Bacillus brevls в концентрации 3x104, с целью повышения всхожести семян и стимулирования развития растений, принятый за прототип..

Штамм Bacillus brevls не является представителем ризосферной микрофлоры и поэтому не конкурентноспособен в зоне корней растений.

Целью изобретения является выделение природного штамма - продуцента рос- тактивирующих веществ, естественным местообитанием которого является корневая система растений, для дальнейшего использования его в сельском хозяйстве.

Штамм Erwinia stewartii TC-183 был выделен из прикорневой зоны дикорастущих растений залежи некосимой Каменной степи Воронежской области в 1982г.

Штамм Erwinia stewartii TC-183 после депонирования во Всесоюзной коллекции микроорганизмов ИБФМ АН СССР имеет регистрационный номер ВКМ В-1888 D.

Штамм характеризуется следующими особенностями: Это неспорообразующие, грамотрицательные, одиночные подвижные палочки, Движутся при помощи перитри- хальных жгутиков. Клетки хорошо растут на обычных питательных средах: мясо-пептон- ном агаре, агаризованном бульоне Хоттин- гера, картофельном агаре, минимальных средах с глюкозой. Морфология колоний определялась после роста 4-5 суток при 28°С. Колонии на МПА серые, в проходящем свете голубые, почти плоские с более выпуклым центром, края гладкие, диаметр 3-5 мм. На МПА с глицерином (2%) колонии белые слабо выпуклые с приподнятым центром, гладкие слизистые блестящие. На среде Кинга А - слабый желто-оранжевый пигмент, диффундирующий в среду: на среде Кинга Б - пигмент желтоватый, зеленый флюоресцирующий пигмент отсутствует.

Факультативный анаэроб. Метаболизм глюкозы дыхательный и бродильный, с незначительным газообразованием. В долот нительных факторах роста не нуждается. Оксадазной активностью не обладает. Желатину не разжижает. Индол не образует. Обладает слабой уреазной активностью. Лизин-, аргинин-, орнитин-декарбоксилазы не образует. Фенилаланиндезаминазы не образует. Образует / -гаяактозидазу. Утилизирует цитрат и малонат Na. He образует кислоты из адонита, дульцита, инозита.

Усваивает с образованием кислоты: глюкозу, сахарозу, лактозу, мальтозу, ксилозу, рамнозу, маннозу, арабинозу, маннит и сорбит. Хорошо растет при температуре от 16 до 37°С, при 4° и 42°С не растет.

Штамм устойчив к следующим антибиотикам: ампициллину (200 мкг/мл), хлорамфениколу (10 мкг/мл), пенициллину (200 . мкг/мл), и чувствителен к тетрациклину (10- 20 мкг/мл), канамицину (50-200 мкг/мл), стрептомицину (50-200 мкг/мл). .

Штамм В КМ В-18888 Due фитотоксичен

и не вирулентен для лабораторных животных,

Штамм хранится на косяках картофельного агара в холодильнике с пересевом на свежие косяки через 2-4 месяца и в лиофильно высушенном состоянии (в ампулах) не менее одного года. При лиофилизации клетки штамма выращивались на агаризованном бульоне Хоттингера в течение суток и смывались раствором для лиофилизации

следующего состава: 1 мл физиологического раствора и 1 мл смеси (10 мл сыворотки крови крупного рогатого скота без консерванта + 1 мл раствора сахарозы 30 г/30 мл), Штамм идентифицирован по определителю Bergy s manual of Systematic

Bacteriology v.1,, ed.Krieg N.R.. Holt J.g,

Williams Wilkins, Baltimore / London, 1984.

Штамм Erwinia Stewartii BKMB-1888 D

подуцирует вещества стимуляторы роста

растений типа гетероауксинов.

Свойства заявляемого штамма иллюстрируются следующими примерами.

П р и м е р 1. Изучение способности штамма синтезировать вещества типа ауксинов.

За основу была принята методика определения ростовых веществ типа ауксинов, описанная Таннером и Андерсоном (10). Испытуемую 1-2 суточную культуру, выращенную на среде Кадо засевали в 1,5 мл среды 925 (11) с добавлением 100 мкг/мл трипто- фана и инкубировали трое суток пи 25-30°С. Затем отбирали по 150 мкл культуральной жидкости, добавляли 1 /2 (75 мкл) реактива

Сальковского. При этом, если в среде присутствует ауксин, то через 30 мин при комнатной температуре должно появиться розовое окрашивание. По интенсивности окраски судят о количестве ауксина.

Среди проверенных штаммов имеющейся в нашем распоряжении коллекции бактерий (около 300), обнаружены штаммы, обладающие способностью синтезировать вещества типа индолилуксусной кислоты

(ИУК). Наиболее активным продуцентом ИУК был заявляемый штамм В-1888 D.

Кроме качественной, реакции было определено количественное содержание ИУК в продуктах метаболизма штамма. Для этой цели была построена калибровочная кривая с разными концентрациями (5-50 мкг/мл. химически чистой ИУК. Определение велось по оптической плотности при длине волны 525 нм. Количество ИУК, синтезируемое штаммом В-1888 D, по калибровочной кривой колебалось от 22 до 60 мкг/мл в зависимости от образца.

Таким образом, штамм Erwinla stewartii В-1888 D обладает способностью синтезировать вещества типа индолилуксусной кислоты.

П р и м е р 2. Изучение влияния продуктов метаболизма штамма В-1888 D на кор- необразование растений.

Для этой цели готовили культуральную жидкость следующим образом. К клеточной суспензии В-1888 D добавляли 1/10 объема хлороформа и встряхивали 15 мин при комнатной температуре. Затем центрифугировали, собирали надосадочную жидкость и встряхивали на качалке при 37°С в течение 15-20 мин. После этого делали необходимые разведения в стерильной воде.

Испытывали диапазон концентрации продуктов метаболизма, соответствующих по калибровочной кривой от 0,00001 до 0,5 с мкг/мл чистой ИУК. Контролем служили те же концентрации ИУК, а также среда 925 и вода. Результаты учитывали по скорости и мощности образования корней. В качестве объектов использовались листья табака и листья фасоли (12).

Результаты приведены в табл.1 и 2.

Продукты метаболизма штамма Erwinla stewartii В-1888 D стимулировали образование корней у обоих взятых для опыта растений. Если в воде и среде 925 укоренение наблюдалось только на 10-11 день, то в варианте с культурой корни появлялись на 7 день опыта и были более мощными по сравнению с контрольными растворами и с

чистой ИУК, соответствующей концентрации.

Действие культуры на корнеобразова- ние проявлялось в очень низких концентрациях (до 0,0001 мкг/мл).

П р и м е р. 3. Изучение влияния штамма В-1888 D на рост растений-саженцев винограда.

Для выяснения влияния живых клеток

культуры штамма В-1888 D на рост растений был поставлен, опыт с саженцами винограда в производственных условиях - в совхозе Краснодарского края. Неодревесневшме черенки винограда сорта Памяти Негруля

нарезали на 2 - глазковые черенки. Нижние срезы черенков помещали в емкость с суспензией штамма В-1888 D на 3-4 часа. Контрольные варианты помещали в емкости с водой на то же время. Затем черенки размещали в установке для зеленого черенкования, где в условиях температуры 25-26°С и постоянного туманообразования они находились в течение 25-30 дней. За этот период формируются корни и трогается в рост верхний глазок (почка). После этого черенки переносили в почву, где они росли в течение вегетационного периода.

Результат опыта приведен в табл.3, Полученные данные показывают, что

предпосевное замачивание черенков винограда в суспензии бактерий штамма В-1888 D способствует улучшению развития растений, что проявляется в величине вызревшего прироста, превышающего этот

показатель в контроле на 22%,

Таким образом, заявленный штамм Erwinla stewartii В-1888 D относится к группе эпифитных бактерий, развитие которых тесно связано с высшим растением и является продуцентом веществ типа гетероаук- синов. Он может быть использован в сельскохозяйственной практике для стимулирования корнеобразования и роста растений.

Формула изобретения

Штамм бактерий Erwinla stewartii BKM В-1888 D для получения стимулятора роста растений.

Таблица. 1 Влияние продуктов метаболизма В-1888 D на образование корней у табака.

Использование: сельскохозяйственная микробиология, производство стимуляторов роста растений. Сущность изобретения: штамм бактерий Erwinia Stewartii TC-183 выделен из прикорневой зоны дикорастущих растений. Депонирован в коллекции ИБФМ АН СССР под номером ВКМ В-1888 D. Штамм выращивают на среде 925 с добавлением 100 мкг/мл триптофана, инкубируют трое суток 25-30°С. Штамм продуцирует вещества типа индолилуксус- ной кислоты (ИУК) в количестве 22-60 мкг/мл. Полученную культуральную жидкость разбавляют водой до концентрации 0,1 и 0,5 мкг/мл ИУК и исследуют влияние полученного стимулятора роста на рост корней табака, укоренение листовых черенков фасоли, рост саженцев винограда. Применение стимулятора роста способствует образованию корней у табака в 2-3 раза больше, чем в контроле, улучшению развития растений винограда на 22%. 3 табл,

Примечание: - отсутствие корней .

+ образование корней / оценка по 5-бальной системе/ корни утолщенные

..-Т а б л и ц а 2 Влияние продуктов метаболизма В-1888 Р на укоренение листовых черенков фасоли.

:. ,.. :..:; .-.Т а б л и ц а 3 Влияние водной суспензии клеток штамма В-1888 D на рост саженцев винограда.