ШТАММ БАКТЕРИЙ PSEUDOMONAS MALTOPHILIA ДЛЯ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ПРЕПАРАТА ПРОТИВ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ ЗАБОЛЕВАНИЙ РАСТЕНИЙ Российский патент 1997 года по МПК C12N1/20 A01N63/00 

Изобретение относится к области сельскохозяйственной микробиологии, биотехнологии и может найти применение в сельском хозяйстве при защите растений от возбудителей их заболеваний.

Известен штамм бактерий Pseudomonas putida, применяемый для приготовления препарата против грибковых заболеваний растений, а также для их защиты от почвенных нематод (патент США N 4751081, кл. 424-33, 1987) прототип.

Однако данный известный штамм не является природным бактериальным штаммом, он сконструирован в лабораторных условиях, что может привести к его перерождению в природных условиях.

Известен штамм Pseudomonas putida, подавляющий рост фитопатогенного гриба Fusarium rkysporum (патент США N 4714614, кл. 424-93, 1987).

Однако отсутствуют сведения о спектре действия данного известного штамма.

Техническим результатом, достигаемым при реализации настоящего изобретения, является обеспечение возможности приготовления препарата против возбудителей заболеваний растений на основе природного штамма бактерий.

Достигается это тем, что штамм бактерий P. mаltophilia BKMCR-332D используется для приготовления препарата против возбудителей заболеваний растений.

Новый штамм выделен из дерново-подзолистой почвы под березняком (Московская область).

Новый штамм характеризуется следующими признаками.

Это неспорообразующие грамотрицательные, прямые или слабо изогнутые короткие палочки, подвижные, с пучком полярных жгутиков. Морфологию колоний на питательных средах определяли после 4-5 суток роста при 28^oC. На мясо-пептонном агаре (МПА) колонии слизистые, выпуклые к центру, желтовато-серые, более желтые в центре. Пигмент -темно-желтый или коричневый, иногда слабый. На органических средах с тирозином штрих голубовато-черный с темно-бурым пигментом, диффундирующим в среду.

На среде Кинга А пигментация отсутствует, на среде Кинга Б образует темно-коричневый, почти черный пигмент, диффундирующий в среду, относящийся к группе меланинов. Зеленый флуоресцирующий пигмент отсутствует.

Физиолого-биохимические признаки штамма
Не растет на минеральной среде без факторов роста (метионина). С некоторыми источниками углерода на среде Хьюг-Лайфсона в аэробных условиях дает сильно щелочную реакцию. Оксидазная реакция (по Ковачу) отрицательная. Обладает сильной протеолитической активностью: быстро и полно разжимает желатин (через сутки при 28^oC). Пептонизирует и часто створаживает молоко. Не способен к истинной денитрификации. Не накапливает поли-β-оксибутират. Не образует из сахарозы леван, не гидролизует крахмал. Продуцирует каталазу. На МПА с цистеином образует сероводород. Активно образует лизин-декарбоксилазу и слабее аргинин-дегидролазу. Уреазной активностью не обладает.

Не растет при +4^oC и +41^oC. Оптимальная температура для роста - 28-30^oC. Не растет при pH 4,5. Растет на МПА с 3% NaCl.

Характерной особенностью является относительно ограниченный спектр источников углеводов, пригодных для роста. Утилизирует цитрат и малонат натрия. Хорошо растет на минеральной среде с аммонийными солями. Нитратные соли не использует в качестве единственного источника азота.

Новый штамм устойчив к ампициллину (200 мкг/мл), тетрациклину (10 мкг/мл), чувствителен к хлорамфениколу (20-50 мкг/мл), стрептомицину (100 мкг/мл).

Новый штамм не фитотоксичен, о чем свидетельствует отсутствие мацерации на ломтиках картофеля и некротических пятен на листьях табака при нанесении на них уколом суспензии живых клеток штамма. Штамм не вирулентен для лабораторных животных.

Хранится штамм на косяках картофельного агара в холодильнике с пересевом на свежие косяки через 2-4 месяца и в лиофильно высушенном состоянии (в ампулах) не менее одного года.

Для получения лиофильно высушенного препарата клети штамма выращивали в течение суток на агаризованном бульоне Хоттингера и смывали следующим составом: 1 часть физиологического раствора + 1 часть смеси, приготовленной из 10 частей сыворотки крови крупного рогатого скота без консерванта и 1 части раствора сахарозы 1 г/мл.

Штамм идентифицирован:
1) по первоисточнику Hugh R. //Int. J. Syst. Bact. 1981, V. 31, N 2, p. 195;
2) по первоисточнику Komagata K et all. //Int. J. Syst. Bact. 1974, V. 24, p. 242;
3) по определителю Krieg N. R. et all. //Bergey's manual of Systematic Bacteriology, 1981, V. 1.

Пример 1. Штамм Pseudomonas maltophilia ВКМ CR-332D выращивали на среде следующего состава (г/л):
Дрожжевой экстракт 0,5
(NH₄)₂SO₄ 1
MgSO₄ x 7H₂O 0,3
KH₂PO₄ 1,36
Перед стерилизацией pH среды доводили до 7,0 4%-ным раствором NaOH. В качестве единственного источника углерода в среду вводили коллоидный хитин, полученный обработкой хитина из экзосколета краба концентрированной HCl (Enthomophage, 1975, V. 20, N 1, p. 43-48). Готовили водную суспензию коллоидного хитина (1: 1) и добавляли в среду в конечной концентрации 2% (по объему). Субстрат и соли стерилизовали отдельно.

Штамм выращивали в течение 7 суток при +28^oC, после чего клетки отделяли фильтрованием. Фильтрат использовали для получения препарата хитинолитических ферментов ферхита, а клетки штамма в виде суспензии либо в лиофилизированном виде (с наполнителем либо без него) использовали как препарат для защиты растений от фитопатогенов. Рабочая суспензия клеток содержит 5•10⁶ 5 •10⁹ клеток/мл.

Пример 2. Методом агаровых блоков изучили антагонистическое действие нового штамма на фитопатогенные грибы. Культуру клеток штамма высевали "сплошным газоном" на поверхность питательного агара (МПА с 2% глицерина или серы Кинга Б) и выращивали при 28^oC в течение 2-3 суток. Затем пробочным сверлом (диаметр 8-10 мм) вырезали "блочки" и переносили их на поверхность другой питательной среды (среда Чапека или картофельный агар), предварительно засеянной глубинным способом тест-культурой фитопатогенного гриба (около 100 спор на 1 мл среды). Чашки помещали в термостат при 28-30^oC. Учет проводили по зонам отсутствия или подавления роста гриба вокруг диска с культурой нового штамма через 3-6 суток (в зависимости от скорости роста тест-культуры). Результаты представлены в таблице 1 и показывают высокую антагонистическую активность нового штамма против фитопатогенных грибов.

Пример 3. Выращивание маточных посадок гвоздики ремонтантной в совхозе "Оранжерейный комплекс" Московской области с целью получения посадочного элитного материала укорененных черенков гвоздики генерации M² ранее приводило к массовому заражению выращиваемых маточных растений M¹ возбудителем увядания гвоздики Fusarium oxysporum к концу третьего месяца и к выпаду к этому времени до 35-40% растений. При этом в оставшихся растениях скрытая фузареозная инфекция достигала 70% что делало полностью невозможным использование таких маточных растений для производства элитного посадочного материала.

При внесении в субстрат для выращивания растений гвоздики генерации M¹ клеток штамма Pseudomonas maltophilia ВКМ CR-332D позволило выращивать растения в течение 8-10 месяцев. В таблице 2 приведены данные по выпаду растений и по их зараженности скрытой нефтяной инфекцией, свидетельствующие об эффективности применения нового штамма.

Таким образом, препарат, приготовленный на основе бактериального штамма согласно изобретению, является эффективным средством защиты растений от возбудителей их заболеваний.

Использование: в сельскохозяйственной микробиологии, в производстве средств защиты растений от фитопатогенных грибов. Сущность изобретения: штамм бактерий Pseudomonas maltophilia ВКМ СК-332Д выделен из дерново-подзолистой почвы под березняком. Депонирован во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов под номером CR-332D. Штамм выращивают на среде, содержащей в качестве источника углерода хитин, источника азота, фосфора в течение 7 суток при 28^oC, затем клетки отделяют от среды и используют полученные клетки для защиты растений от фитопатогенов в виде суспензии с титром клеток 5•10⁶ - 5•10⁹. 2 табл.

Штамм бактерий Pseudomonas maltоphilia ВКМ CR-332D для приготовления препарата против возбудителей заболеваний растений.