СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ШТАММА БАКТЕРИЙ AGROBACTERIUM TUMEFACIENS ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА, ПРЕДУПРЕЖДАЮЩЕГО ЗАБОЛЕВАНИЕ РАСТЕНИЙ БАКТЕРИАЛЬНЫМ РАКОМ, И ШТАММ БАКТЕРИЙ AGROBACTERIUM TUMEFACIENS ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА, ПРЕДУПРЕЖДАЮЩЕГО ЗАБОЛЕВАНИЕ РАСТЕНИЙ БАКТЕРИАЛЬНЫМ РАКОМ Советский патент 1994 года по МПК A01N63/00 C12N15/00 

Изобретение относится к сельскому и лесному хозяйству и касается производства средств защиты растений от бактериального рака.

Целью изобретения является упрощение процесса и получение нового штамма бактерий Agrobacterium tumefaciens, являющегося более эффективным и обладающего более широким спектром действия, что позволяет защищать большее число видов растений.

Штамм получен путем передачи с помощью конъюгации антионкогенной плазмиды R388 в клетки выделенного штамма Agrobacterium tumefaciens 759, проявляющего антагонистическое действие против вирулентных агробактерий нопалинового и октопинового типов.

Полученному штамму присвоен N 760. Штамм депонирован во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов под N В-4116.

П р и м е р 1. Штаммы-антагонисты вирулентных агробактерийAgrobacterium tumefaciens 607, 636 и 759 выделяют с растений винограда (с корней, лозы и побегов соответственно). Штаммы синтезируют агроцины - вещества, подавляющие рост вирулентных агробактерий нопалинового и октапинового типов, на минимальных солевых средах с глюкозой (или сахарозой, глицерином); штамм А. tumefaciens 636 проявляет слабое антагонистическое действие также на богатых средах (агаризованный бульон Хоттингера, L-бульон). Указанные штаммы являются онкогенными и вызывают образование опухолей на винограде, горохе, моркови, каланхоэ, томате. Для подавления онкогенности выделенных штаммов-антагонистов в них передают с помощью коньюгации антионкогенные плазмиды pSA и R388.

Полученные в результате штаммы являются неонкогенными и не образуют опухолей на растениях. Плазмида R388 стабильно сохраняется в клетках полученных штаммов на неселективной среде, а плазмида pSA теряется из штаммов 636 и 759 после 10-20 пересевов в этих условиях. Поэтому более целесообразно использовать плазмиду R388, дальнейшая работа проведена только с ней. Штаммы агробактерий, в которые была передана плазмида R388, называют соответственно. A. tumefaciens 608, 637 и 760.

Ниже приводятся методические приемы, использованные для передачи плазмиды R388.

Суспензии донора Escherichia coli J 53(R388) и реципиентов A. tumefaciens 759, 607 и 636 в экспоненциальной фазе роста смешивают 1: 1 и по 0,1 мл этой смеси каплями распределяют на чашку с 1,5% агаризованной средой 523 следующего состава, г/л дистиллированной воды: дрожжевой экстракт 4,0; гидролизат казеина 8,0; K₂HPO₄ 3,0; MgSO₄ 0,3; сахароза 10,0. После инкубации в течение 48 ч при 28^оС бактерии смывают с поверхности среды 3 мл фосфатного буфера (pH 7,2) и высевают из нескольких разведений на минимальную среду 925 следующего состава, г/л дистиллированной воды: K₂HPO₄ 3,0; NaH₂PO₄ 1,0; NH₄Cl 1,0; MgSO₄ ˙ 7H₂O 0,3; сахароза 10,0, содержащую триметоприм (400 мкг/мл) и этазол натрия (100 мкг/мл). Трансконъюганты отбирают и дважды очищают до отдельных колоний.

Полученные штаммы агробактерий предохраняют растения от опухолеобразования (примеры 3, 4, 5). Наибольший эффект проявил штамм A. tumefaciens 760.

Штамм A. tumefaciens 760 характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки.

Клетки прямые, мелкие палочки 0,8-1,0х3,0 мкм, подвижные, грамотрицательные, неспорогенные.

Культуральные признаки.

Клетки хорошо растут на простых питательных средах - мясопептонном агаре, агаризованном бульоне Хоттингера, картофельном агаре, минимальных средах с глюкозой, сахарозой. маннитом. При росте на агаризованном бульоне Хоттингера, питательном агаре Дифко, мясопептонном агаре колонии гладкие, круглые, блестящие, сероватые, край ровный; часто слизистые, особенно на средах с углеводородами - (0,5-1% ) при 30^оС при росте одни сутки. При выращивании на жидких средах (523, LB, бульон Хоттингера) без аэрации образуют пленку, при росте с перемешиванием на качалке - густую муть, иногда с небольшими кусочками пленки.

Физиолого-биохимические признаки.

Аэроб. Клетки растут в пределах 4-38^оС, с температурным оптимумом 25-30^оС (оптимум pH 7-8).

Прототроф.

В качестве источников углерода используют глюкозу, арабинозу, ксилозу, галактозу, сахарозу, лактозу, мальтозу, рафинозу, рамнозу, глицерин, сорбит, дульцит, инозит, маннит. При ферментации этих веществ образуется кислота без газа.

В качестве источников азота используют как минеральные соли в аммонийной форме, так и в органической форме в виде пептона, аминокислот.

Нитраты не редуцируют.

Крахмал не гидролизуют.

Желатину не разжижают.

Молоко свертывают, но не пептонизируют.

Образуют 3-кетолактозу.

Образуют индол, сероводород, аммиак.

Разлагают с образованием кислоты следующие аминокислоты: l-гистидин, dl-лизин, dl-орнитин, l-аргинин, l-пролин, dl-серин. С образованием щелочи разлагают l-аланин, l-аспарагин, l-глутамин.

К агроцину 84 не чувствителен.

Штамм не фитотоксичен.

Не вызывает образования опухолей (галлов) на винограде, горохе, моркови, каланхоэ, томате, подсолнечнике.

Плазмиды.

Содержат плазмиду pTi слабо октопинового типа и плазмиду R388, определяющую устойчивость к триметоприму и сульфамидам.

Устойчивость к антибиотикам.

Устойчивы (мкг/мл) к канамицину (50), пенициллину (200), стрептомицину (200), триметоприму (400), сульфамидным препаратам (этазолу натрия 100).

Штамм хранится в лиофильно высушенном состоянии не менее одного года. Клетки, выросшие на косяках со средой 523 с 1,5% агара, в течение суток смываются раствором для лиофилизации следующего состава: 1 мл физиологического раствора + 1 мл смеси (10 мл сыворотки крови крупного рогатого скота без консерванта + 1 мл раствора сахарозы 30 г/30 мл).

П р и м е р 2. Изучают антагонистические свойства штамма A. tumefaciens 760 и свойства синтезируемого клетками этого штамма агроцина.

Клетки A. tumefaciens 760 синтезируют агроцин, подавляющий рост агробактерий, на минимальных солевых средах с глюкозой (или сахарозой, глицерином) следующего состава, г/1 л дистиллированной воды: NH₄Cl 1; KH₂PO₄ 1,5; Na₂HPO₄ 3,5; MgSO₄ 0,1; агар Дифко 1,5% ; глюкоза (глицерин, сахароза) - 0,2-0,4% ; pH 7,0-7,5.

Для оценки антагонистических свойств штамма A. tumefaciens 760 и действия агроцина клетки засевают уколом на чашки с указанной выше средой и выращивают двое суток при 28-30^оС. Выросшие колонии убивают парами хлороформа, после чего поверхность среды заливают вторым слоем 3 мл 0,7% агаровой среды того же состава, смешанной с 0,1 мл индикаторной культуры, выросшей до экспоненциальной фазы роста (1-3х10⁸ кл/мл) на качалке в жидкой среде того же состава.

Вокруг колоний образуются прозрачные зоны диаметром 10-20 мм. Подавляется рост штаммов агробактерий, несущих плазмиды октопинового и нопалинового типов.

Агроцин диффундирует через целлофан, не инактивируется трипсином, химотрипсином, проназой, субтилизином, рибонуклеазой и дезоксирибонуклеазой.

П р и м е р 3. Препарат для защиты растений от бактериального рака получают следующим образом. Клетки штамма 760 выращивают в течение двух суток при 30^оС на чашках или матрицах с агаризованной средой 523, затем смывают фосфатным буфером (pH 7,2) и разводят до титра 10⁸ - 10⁹клеток на 1 мл. С 1 см² поверхности питательной среды получают 6 ˙ 10⁹клеток. Для выращивания бактерий можно также использовать картофельный агар, для смывания - физиологический раствор или стерильную прокипяченную воду.

П р и м е р 4. Изучают способность штаммов, полученных новым способом, защищать растения гороха от бактериального рака при совместном заражении с онкогенными штаммами.

Выращенные в течение двух суток на косяках среды 523 клетки штаммов A. tumefaciens lDl (получен из США) 8628 (получен из Института микробиологии и вирусологии АН УССР), 760 и 637 суспендируют в фосфатном буфере pH 7,2 до титра 10⁸ -10⁹ кл/мл. Трехсуточные проростки гороха сорта Уладовский юбилейный декапитируют с помощью бритвы и на срез наносят в виде капли суспензии онкогенных штаммов Agrobacterium tumefaciens lDl или 8628, смешанные в соотношении 1: 1 с буфером, или смешанные в том же соотношении суспензии указанных онкогенных штаммов с неонкогенными штаммами 760 и 637. Проростки инкубируют при 22-24^оС в кюветах с водой. Учет образования опухолей проводят на 12-15 день после заражения.

Защита растений гороха от бактериального рака клетками A. tumefаciens 760 и 637 при совместном заражении с онкогенными штаммами A. tumefaciens lDl и 8628.

Из данных табл. 1 видно, что клетки штаммов A. tumefaciens 760 и 637 защищают растения гороха от бактериального рака при совместном заражении с клетками онкогенных штаммов lDl и 8628. При использовании онкогенного штамма A. tumefaciens lDl число растений, пораженных опухолями, снижается со 100% до 10,3 и 13,3% соответственно в присутствии клеток штаммов A. tumefaciens 760 и 637; при использовании онкогенного штамма A. tumefaciens 8682 - с 81,8% до 2,2 и 4,4% .

П р и м е р 5. Изучают возможность применения штаммов A. tumefaciens 760 и 608 для предупреждения образования опухолей на проростках гороха.

Выращивание клеток и получение опухолей на проростках гороха проводят как в примере 4. На срезы проростков гороха наносят в виде капли суспензии клеток штаммов A. tumefaciens 760 и 608. После подсыхания капли через 1 ч на срезы наносят капли суспензии онкогенных штаммов A. tumefaciens lDl или 8628.

Из табл. 2 видно, что предварительная обработка срезов проростков гороха суспензиями клеток A. tumefaciens 760 и 608 предохраняет растения гороха от опухолеобразования, вызываемого клетками онкогенных штаммов A. tumefaciens lDl или 8628.

П р и м е р 6. Изучают возможность защиты растений винограда от бактериального рака предварительной обработкой черенков суспензией клеток A. tumefaciens 760.

Неодревесневшие черенки винограда сорта Молдова нарезают на двухглазковые черенки. Нижние срезы черенков помещают в емкость с суспензией штамма A. tumefaciens 760 (10⁸-10⁹ кл/мл) на 30-60 мин. Контрольные варианты помещают в емкости с водой на то же время. Затем черенки размещают в установке для зеленого черенкования, где при 25-26^оС и постоянном туманообразовании они находятся в течение 25-30 дней. За этот период формируются корни и трогается в рост верхний глазок (почка). По прохождении этого периода черенки вынимают из пенополистирола и анализируют на наличие опухолей, которые формируются на раневой поверхности нижнего среза черенка.

Из данных табл. 3 видно, что обработка черенков винограда суспензий клеток A. tumefaciens 760 подавляет образование опухолей, вызванных латентной инфекцией. (56) Патент Франции N 2528866, кл. C 12 N 11/00, 1986.

Изобретение относится к сельскому и лесному хозяйству и касается производства средств защиты растений от бактериального рака. Цель - упрощение способа и получение нового штамма бактерий Agrobacterium, являющегося более эффективным и обладающего более широким спектром действия, что позволяет защитить большее число видов растений. Штамм A. tumefaciens 760 депонирован во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов под N 4116. Штамм получен путем передачи с помощью конъюгации антионкогенной плазмиды R 388 в клетки выделенного штамма Agrobacterium tumefaciens N 759, проявляющего антагонистическое действие против вирулентных агробактерий нопалинового и октопинового типов. Предлагаемый штамм защищает растения гороха, винограда примерно на 77 - 79% . Способ заключается в том, что выделяют онкогенный штамм против вирулентных агробактерий. 2 с. п. ф-лы, 3 табл.

1. Способ получения штамма бактерий Agrobacterium tumefaciens, предупреждающего заболевание растений бактериальным раком, включающий выделение штамма-антагониста онкогенных бактерий из природного материала, отличающийся тем, что, с целью упрощения способа, выделяют онкогенный штамм, проявляющий действие против вирулентных агробактерий, и в него вводят антионкогенную плазмиду. 2. Штамм бактерий Agrobacterium tumefaciens ВКПМВ-411 для получения препарата, предупреждающего заболевание растений бактериальным раком.