Штамм бактерий PSEUDOMONAS FLUORESCENS для получения препарата против возбудителей заболеваний растений Советский патент 1997 года по МПК A01N63/00 C12N1/20 

m

Использование: сельское хозяйство, получение средств защиты растений от возбудителей заболеваний и касается нового штамма для получения вышеуказанного средства. Сущность изобретения: штамм Pseudomonas fluorescens выделен из чернозема. Депонирован в ВКМ под номером CR-330D. Для получения препарата штамм выращивают на агаризованной среде Хот- тингера или картофельном агаре, или мя- сопептонном агаре, затем смывают физиологическим раствором или стерильной водой, разводят до титра 10 - 10 кл/мл. Полученную суспензию используют для защиты растений от фитопатогенов, таких как Alternaria solani, Helminthosporium sativum, Rhirocfonia solani. 5 табл. с/3 с 00 bJ 1 u ь. ON u

VO ТГ

T)

fs

00

p

Ю

Изобретение относится к сельскому хозяйству и касается штамма, который оказывает антагонистическое действие на фитопатогенные грибы и бактерии, и может быть использовано для зашиты растений от заболеваний, вызываемых фитопатогенами.

Известен штамм Pseudomonas sp., подавляющий рост гриба Helminthosporium sativum - возбудителя корневой гнили злаковых растений.

Однако отсутствуют сведения о действии этого штамма на другие фитопатогены.

Известен штамм Pseudomonas putida, подавляющий рост фитопатогенного гриба Fusarium oxysporum.

Однако не описано его действие на другие фитопатогены.

Известен штамм Pseudomonas cepacia 526, активный против широкого спектра фитопатогенных грибов.

Однако отсутствуют сведения о его действии на рост грибов Botrytis spp., Helminthosporiumspp.,Fusarium

heterospolum, Fusarium solani, а также на фитопатогенные бактерии.

Целью изобретения является выделение природного штамма бактерий с широким спектром антагонистического действия на фитопатогенные грибы и бактерии.

Новый штамм Pseudomonas fluorescens ВКМ CR-330D был выделен в 1982 году из чернозема под некосимой залежью в Каменной степи (Воронежская область).

Новый штамм характеризуется следующими признаками.

Это грамотрицательные, подвижные короткие палочки с полярными жгутиками, спор не образуют, размер 0,6x1,5 - 2,0 мкм. Клетки хорошо растут на простых питательных средах: мясопептоном агаре (МПА), агаризованном бульоне Хоттингера, картофельном агаре, минимальных средах с глюкозой или глицерином.

Морфология колоний на агаризованных средах (при 28°С на 3 - 5-й день):

на МПА колонии гладкие, беловатые, часто имеют слабый розовый оттенок, выпуклые, слизистой консистенции, диаметр 5-8 мм;

на МПА с 2% глицерина наблюдается диссоциация на три колониальных типа:

1)серые или желтовато-серые, слабо выпуклые, маслянистой консистенции,

2)слизистые, выпуклые с розовым оттенком, крупные,

3)розовые, более плотные и мелкие. Пигмент на МПА желто-зеленый, диффундирующий в среду.

Пигментация на диагностических средах Кинга для флуоресцирующих псевдомонад (King E.O. at all. Two simple media for the demonstration of pyocyanin and fluorescin. - J. Lab. Clin, Med., 1954, v. 44, p. 301).

Кинг А - пигмент отсутствует,

Кинг Б - зеленый флуоресцирующий интенсивный пигмент.

Физиолого-биохимические свойства: строгий аэроб, метаболизм глюкозы окислительный. В факторах роста не нуждается. Обладает активными протеолитическими свойствами: разжижает желатин, пептонизи- рует молоко. Редуцирует нитраты до нитритов.

Образует леван из сахарозы.

Максимальная температура роста на питательных средах равна 35°С, минимальная -4°С, оптимальная -28°С. Хорошо растет при рН 5,0 - 8,0.

В качестве единственного источника углерода усваивает арабинозу, ксилозу, глюкозу, сахарозу, глицерин и не усваивает рамнозу, галактозу, рафинозу, мальтозу, сорбит, маннит, дульцит, инозит, инулин.

Из источников азота лучше использует нитратную форму, чем аммонийную. Новый штамм устойчив к антибиотикам: ампициллину (200 мкг/мл), тетрациклину (10 мкг/мл), хлорамфениколу (200 мкг/мл) и чувствителен к стрептомицину (100 мкг/мл), канамицину (100 мкг/мл).

Штамм не фитотоксичен, о чем свидетельствует отсутствие мацерации на ломтиках картофеля и некротических пятен на листьях табака при нанесении на них уколом суспензии живых клеток штамма.

Штамм не вирулентен для лабораторных животных: при введении одиннадцати мышам внутрибрюшинно суспензии его клеток по 250 млн клеток в объеме 0,5 мл в течение 10 дней животные не погибали.

Новый штамм хранится на косяках картофельного агара в холодильнике с пересевом на свежие косяки через 2-4 месяца и в лиофильно-сухом состоянии (в ампулах) не менее 1 года.

Штамм идентифицирован: 1) по первоисточнику H.Stolp, D.Dadkari in The Prokaryotes, Berlinea, 1981, v. 1, cb. 61, p. 719 - 741; 2) по определителю Bergey s Manual of systematic Bacteriology, v. 1, ed. Krieg N.R. et al., Baltimore/London, 1984.

Ниже приведены примеры, описывающие свойства нового штамма и показывающие возможность его применения для защиты растений от заболеваний.

Пример 1. Клетки штамма Pseudomonas fluorescens BKM CR-330D выращивали в течение суток при 30°С на чашках или матрицах с агаризованным бульоном Хоттин- гера или картофельным агаром, или с МПА, затем смывали физиологическим раствором или стерильной водой и разводили до титра 108 - 10 клеток на мл. С 1 см поверхности питательной среды получали 109 клеток. Полученную суспензию клеток использовали как препарат для защиты растений от фитопатогенов. Клетки можно смывать средами, обычно применяемыми при лиофили- зации, а полученную суспензию можно лиофилизировать.

Пример 2. Методом агаровых блочков изучили антагонистическую активность штамма против фитопатогенных грибов. Культуру бактерий Pseudomonas fluorescens BKM CR-330D высевали сплошным газоном на поверхность питательного агара (МПА с 2% глицерина или среда Кинга Б) и выращивали при 28°С в течение 2-3 суток. Затем пробочным сверлом (диаметр 8-10 мм) вырезали диски (агаровые блочки) и помещали их на поверхность сплошного газона тест-культуры фитопатогенного гриба. (Газон получен посевом глубинным способом суспензии клеток тест-культуры из расчета около 100 спор на 1 мл среды на среду Чапека или на картофельный агар). Чашки с газоном тест-культуры с помещенными на него агаровыми блочками, содержащими клетки нового штамма, помещали в термостат при 28 - 30°С на 3 - 6 суток (в зависимости от скорости роста тест-культуры). Учет проводили по зонам отсутствия роста или подавления роста фитопатогенного гриба вокруг диска.

Результаты приведены в табл. 1 и показывают, что новый штамм имеет широкий спектр действия на фитопатогенные грибы.

Пример 3. Изучали действия штамма Pseudomonas fluorescens BKM CR-330D на фитопатогенные бактерии. Клетки штамма засевали уколом на чашки с различными агаризованными средами: NBY, картофельный агар, бульон Хоттингера с 1,5% агара, минимально - солевая среда с глюкозой следующего состава (г/л дистиллированной воды): NH4C1 I; KH2P04 1,5; N32HP04 3,5; MgS04 0,1; глюкоза (глицерин, сахароза) 2%, агар Дифко 1,5%, рН 7,0 - 7,5. Культуру выращивали 2 суток при 28 - 30°С. Выросшие колонии убивали парами хлороформа, после чего на поверхность среды выливали 3 мл 0,7%-ной агаровой среды того же состава, смешанной с 0,1 мл индикаторной культуры фитопатогенной бактерии, выросшей до экспоненциальной фазы роста (1 - 3x10 кл/мл) на качалке в жидкой среде того же состава. В результате этой операции образовывался второй слой агари- зованной среды с клетками тест-культуры фитопатогенной бактерии. Чашки с двумя слоями агаризованных сред выдерживали при 28°С в течение 3-5 дней. Учет проводили по зонам подавления роста тест-культуры фитопатогенной бактерии вокруг колоний нового штамма.

Полученные результаты приведены в табл. 2 и свидетельствуют о том, что новый штамм проявляет антагонистическую активность относительно большого числа фитопатогенных бактерий.

Пример 4. Семена огурцов сорта Нежинский замачивали в воде (контроль) или в суспензии клеток штамма P. fluorescens BKM CR-330D. После 24 ч замачивания семена в течение 1 сут выдерживали при температуре окружающей среды. Затем семена высевали в ящики с почвой, инокулированной высококонцентрированной суспензией смеси спор фитопатогенных грибов - возбудителей корневых гнилей: Phytium debaryanum H., Phoma lingam D., Tusarium oxysporum Sen., Alteruaria sp., Botrytis cinerea.

Для этого фитопатогенные грибы предварительно выращивали на косяках картофельного агара в течение 5-7 сут, смывали с косяка прокипяченной водой (10 мл на 1 косяк). Для инфицирования 3 - 4 кг почвы готовили суспензии спор с 5 - 7 косяков каждого гриба и полученные суспензии объединяли.

Ящики с семенами содержали в комнатных теплицах Флора при 28°С и световом дне 16 ч. Учет состояния рассады проводили через 49 дней после посева. Результаты представлены в табл. 3. Анализ данных показывает, что обработка семян огурцов суспензий клеток штамма Pseudomonas flurescens BKM CR-330D предотвращает заболевание растений огурца черной ножкой. Наилучшие результаты получены при использовании суспензии клеток нового штамма с титром клеток 10 - 10 клеток/мл. Представленные в табл. 3 данные свидетельствует также о том, что обработка семян суспензией клеток нового штамма приводила к ускорению роста растений огурца.

Пример 5. В производственных условиях совхозов Краснодарского края изучили влияние препарата из клеток нового штамма на степень поражения саженцев винограда бактериальным раком.

Заготовили 2-глазковые неодревесневшие черенки винограда. Нижние срезы черенков помещали на 3 - 4 ч в емкость с суспензией нового штамма. Контрольные растения помещали в емкость с водой на такое же время. Затем черенки размещали в установке для зеленого черенкования, где в условиях температуры 25 - 26°С и постоянного туманообразования они находились 25 - 30 дней. За этот период формируются корни и трогается в рост верхний глазок (почка). После этого черенки переносили в почву, где они росли в течение вегетационного периода. Результаты представлены в табл. 4.

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Штамм бактерий Pseudomonas fluorescens ВКМ CR-330 для получения препарата против возбудителей заболеваний растений.

Т a fin и ц а 1

Антагонистическая активность штамма Pseudomonas fluorescfins ВКМ CR - ЗИП Д относительно фитопатогенных грибов

№N п / п

Виды фитопатогенных грибов

Alternarla sp .

Bofrytls clnerea

Fusarium solan)

Fusarlum heterosporlum

Helmlnthosporlum satlvum

Rhlzoctonla solanl

Примечание : с - стерильная зона,

п - подавление роста.

Пример 6. Препарат из клеток нового штамма использовали для защиты растения гвоздики от грибных заболеваний.

Базальные срезы черенков гвоздики на 3 - 4 ч замачивали в суспензии клеток штамма (титр 10 клеток/мл) и затем высаживали в перлит для укоренения. Контрольные черенки замачивали в воде. Результаты приведены в табл. 5.

Таким образом, препарат из нового штамма позволяет защищать растения от бактериальных и грибковых заболеваний.

Радиус зоны отсутствия или подавления роста гри- ба. мм

10с

20с

20 п

Юс

Юс

20с

Таблица 2

Подавление роста бактерий вокруг колоний штамма Pseudomonasfluorescens BKM CR330 Д

Примечание : - означает : определение не проводили.

Продолжение табл. 2

Примечание : - означает: определение не проводилось.

Таблиц а 4

Применение штамма PseudomonasfluorescensBKM CR-ЗЗОД для защиты от бактериального рака корнесобственных саженцев винограда

Таблица 3

Таблица 5

Применение препарата иэ нового штамма для защиты растений гвоздики от грибных

заболеваний