Способ определения витамина А в биологическом материале Советский патент 1993 года по МПК A23K1/00 

Ю

С

Изобретение относится к аналитической химии. Цель изобретения - ускорение и упрощение анализа, а также повышение точности достигается тем, что экстракцию витамина А ведут при температуре 65-75°С в течение 6-10 мин двухкомпонентным экс- трагентом при следующем соотношении ингредиентов, об.%: изопропиловый спирт 95,0-98,0; вода 5,0-2,0, а полученный экстракт анализируют на жидкостном хроматографе с использованием сорбента силасорб SPH Сш и элюента следующего состава, об.%: ацетонитрил - н-пропанол - вода 42:50:8. 3 ил., 4 табл.

Изобретение относится к аналитической химии, в частности к способам определения содержания витамина А в микрогранулиро- ванном препарате и премиксах.

Определение витамина А возможно экстра кционно-спектрофотометричес ким методом по его собственному светопогло- щению в УФ-области спектра. Известен и широко распространен фотометрический метод анализа витамина А, основанный на образовании окрашенных комплексных соединений. Соединения группы витамина А способны к образованию окрашенных продуктов реакции при взаимодействии с хлоридом сурьмы в хлороформе. Особенностью этой реакции является то, что относительная скорость распада окрашенного карбо- ниевого иона очень высока и максимум интенсивности окрашивания наблюдается между 5-й и 10-й секундами от начала введения реагента. При замере оптической плот- ности позже 10-й секунды получаемые

результаты занижены, т.е. резко снижается точность измерения. Неустойчивость окраски комплексного соединения - существенный недостаток данного метода, затрудняющий его практическое использование.

Известны также хроматографические способы определения витамина А в различных биологических объектах.

Наиболее близким по технической сущности к изобретению является способ определения содержания витамина А в молоке, заключающийся в извлечении витамина А из молока и хроматографическом анализе полученного экстракта.

Извлечение витамина А осуществляется в несколько стадий.

VJ о о

00

ю ел

количественному определению витамина А (жиры, липиды и пр.).

Полученный таким образом концентрат витамина А, очищенны.й of мешающих при- месей, подвергается хроматографическому анализу. В качестве сорбента используют VydacTPCis, состав элюента следующий, об.%: ацетонитрил-метанол 90:10. Время, необходимое для выполнения анализа со- ставляет 2-2,5 ч.

Однако известный способ имеет следующие недостатки:

сложность и длительность процесса экстракции витамина А за счет многостадий- ности процесса и соответственно большие потери витамина;

разрушение и изомеризация витамина А за счет его нестойкости в растворах и водных средах при нагревании в процессе омыления;

использование в составе элюента для хроматографирования метанола, являющегося сильным ядом.

Целью изобретения является ускорение и упрощение анализа, а также повышение точности определения витамина А.

Это достигается тем, что в известном способе определения витамина А в микро- вите А кормовом и премиксах, заключаю- щемся в извлечении витамина и анализе полученного экстракта методом жидкостной хроматографии, экстракцию ведут при температуре 65-75°С в течение 6-10 мин водным раствором изопропилового спирта при следующем соотношении компонентов, об.%:

Изопропиловый спирт 95-98

Вода. 5-2, а полученный экстрактанализируют на жид- костном хроматографе с использованием сорбента силасорб SPHCis и элюента - смеси ацетонитрила и спирта, причем в качестве спирта использован водный раствор н-пропанола при объемном соотношении: ацетонитрил - н-пропанол - вода 42:50:8.

На фиг.1 приведена хроматограмма раствора масляного препарата витамина А (ретинол-ацетат) в изопропиловом спирте; на фиг.2 и 3 - соответственно хроматограм- мы экстрактов витамина А из микровита А и премикса.

Способ определения витамина А в мик- ровите Айв премиксах осуществляется следующим образом.

П р и м е р 1. Объект исследования - микровит А кормовой (далее микговит А).

Навеску микровита А в количестве 0,02 г, взятую с точностью 0,0005 г, помещают в коническую колбу объемом 25 см3, куда наливают 10 см3 экстрагента, содержащего изопропиловый спирт - 97,0 об.% и воды 3,0 об.%. Колбу соединяют с обратным холодильником и помещают в водяную баню с температурой 75°С на 1.0 мин. Затем полученную смесь охлаждают до комнатной температуры и фильтруют через фильтр Шотта. Фильтрат собирают в мерную колбу объемом 25 см . Коническую колбу и осадок на фильтре тщательно промывают э.кс- трагентом и раствор в колбе доводят до метки.

Полученный раствор витамина А хрома- тографируют на жидкостном хроматографе Милихром. Использована колонка 2 ммх80 мм, заполненная силасорбом ЗРНСш. В качестве злюента выбрана смесь ацетонитрил - н-пропанол - вода 42:50:8 (об.%). Измерения проводились с применением УФ-детектора на длине волны 328 нм. Объем пробы составлял б мкм, скорость подачи элюента через колонку - 200 мкл/мин. Время, затрачиваемое на анализ, включая экстракцию, составляет 40- 45 мин. Хроматограмма экстракта из микровита А приведена на фиг.2.

Содержание витамина А в анализируемом экстракте определяют по калибровочному графику, который строится в координатах высота хроматографическо.го пика - содержание витамина А. Для построения калибровочного графика хрома- тографируют 5-6 растворов масляного раствора витамина А известных концентраций в изопропиловом спирте (фиг.1). Удерживаемый объем пика витамина А соответствует 345 мкл. На хроматограмме экстракта витамина А из микровита А (фиг.2) измеряют высоту пика, а затем по калибровочному графику определяют содержание витамина А в анализируемом экстракте.

Для расчета содержания витамина А в микровите А используется формула

СА(D

Х

пл

где X - содержание витамина А в анализируемом образце, МЕ/г;

Сд - содержание витамина А в экстракте, определенное по калибровочному графику, ME;

m - навеска анализируемого образца, г.

П р и м е р 2. Объект исследования - премикс.

Навеску премикса в количестве 5 г, взятую с точностью 0,0005 г, помещают в кони- ческую колбу объемом 25 см3, куда наливают 15 см3 экстрагента, содержащего изопропиловый спирт - 97,0 об.% и воду - 3,0 об.%. Колбу соединяют с обратным холодильником и помещают в водяную баню с температурой 75°С на 10 мин. Затем полученную смесь охлаждают до комнатной температуры и фильтруют через фильтр Шотта. Фильтрат собирают в мерную колбу объемом 25 см . Коническую колбу и осадок на фильтре промывают экстрагентом и раствор в колбе доводят до метки. Полученный экстракт хроматографируют на жидкостном хроматографе Милихром при следующих условиях. В качестве сорбента используют обращенную фазу силасорб SPH Cis. Элюент имеет состав, об.%: ацетонитрил - н-пропиловый спирт- вода 42:50:8. Измерения проводились с использованием УФ-де- тектора на длине волны 328 нм. Объем пробы составлял 6 мкл, скорость подачи элюента 200 мкл/мин. Время анализа, включая экстракцию, не превышает 40- 45 мин. Хроматограмма экстракта из премикса П 5-1 приведена на фиг.З. Обработка полученных результатов и расчет содержания витамина А в премиксе выполняются так, как описано в примере 1.

В табл.1 приведены данные, позволяющие оценить точность определения витамина А в премиксах. Для этого в лабораторных условиях готовились премиксы с точно известным содержанием витамина А, которое затем определялось так, как описано в примере 2.

Из данных табл.1 следует, что относительное отклонение отдельного определения не превышает 7,8%. Причем, расхождения между параллельными определениями не превышает 4-5 отн.%. Согласно действующему в настоящее время ГОСТу 26573.1-85. (Премиксы. Метод определения витамина А) эта величина может достигать 15 отн.%.

С целью оптимизации условий экстракции в итамина А из Микровита А и премиксов проводились специальные исследования состава экстрагента, времени и температуры экстракции.

В табл.2 представлены результаты исследования влияния состава экстрагента на эффективность экстракции витамина А из Микровита А.

Как видно из полученных результатов, при содержании воды в изопропиловом спирте менее 2,0 об.% наблюдается неполная экстракция, и количество неэкстрагированного витамина А составляет 9,7-22,9%.

Это связано с тем, что оболочка Микровита А растворима в воде, но не растворима в органических растворителях. При малых концентрациях воды в экстрагенте гранулы

Микровита А разрушаются недостаточно, и значительная часть витамина А остается внутри гранул. То есть в данном случае экстракция малоэффективна. Если концентрация воды в экстрагенте превышает 5,0 об. %,

0 наблюдается существенное растворение полимерной оболочки гранул, и примеси переходят в раствор вместе с витамином А, появляются признаки Образования коллоидной системы в виде слабой мути и осадка

5 при хранении экстракта в течение нескольких часов. При этом наблюдается значитель-. ное снижение точности определения витамина на 10-11,5%.

Начиная с концентрации воды в экстра0 генте 9,0-10,0 об.%. экстракт становится интенсивно мутным и далее не анализируется.

В табл.3 и 4 приведены данные по влиянию температуры и времени экстракции

5 витамина А из Микровита А.

Использование температур ниже 65°С при условии, что состав экстрагента следующий, об.%: изопропиловый спирт-вода 97:3, а время экстракции 10 мин, не позво0 ляет полностью экстрагировать витамин А. Доля неэкстрагированного витамина значительна - от 6,9% и выше. При температуре экстракции выше 75°С активность витамина А резко снижается вследствие его разруше5 ния. Так, при нагревании раствора втечение 10 мин при температуре 80°С количество определяемого витамина А на 11,6% меньше его содержания в Микровите А, определенного по ТУ 64-05-130-76.

0Время экстракции 5 мин и ниже даже при максимальной температуре экстракции - 75°С при условии, что состав экстрагента следующий, об.%: изопропиловый спирт - вода 97:3, не обеспечивает доста5 точно полного извлечения витамина А из микрогранул. Доля неэкстрагированного витамина А составляет 11,7%. При увеличении времени экстракции до 15 мин и выше происходит разрушение витамина А, кроме

0 того, в экстракт переходят компоненты оболочки гранул, раствор становится коллоидным и далее не анализируется.

Поскольку витамин А в премиксы вводится в виде Микровита А, условия экстра5 кции и получаемые результаты в процессе определения содержания витамина А в премиксах и Микровите А кормовом одинаковы.

Использование предлагаемого способа по сравнению с прототипом позволяет значительно упростить анализ, более чем вдвое уменьшить продолжительность анализа и повысить точность анализа в 2 раза за счет сокращения количества операций (с 3 до 1), что способствует уменьшению потерь исследуемого образца и параллельно с этим сокращению числа (от 7 до 4) и расхода (с 200 см до 25 см ) применяемых реактивов.

Формула изобретения Способ определения витамина А в био,- логическом материале путем экстракции ви- тамина из исследуемого материала с

0

5

последующим жидкостным хроматографи- ррванием на сорбенте с использованием элюента - смеси ацетонитрила и спирта, о т- личающийся тем, что, с целью повышения точности, а также ускорения и упрощения способа, экстракцию проводят 95-98%-ным водным раствором изопропи- лового спирта при температуре 65-75°С в течение 6-10 мин, а в качестве сорбента используют силасорб SPHCis, причем элюент в качестве спирта содержит водный раствор н-пропанола при объемном соотношении ацетонитрил:н-пропанол:вода, равном 42:50:8.

Таблица 1

Таблица 2

Таблица 3

1234

Время, мин.

Фиг.1

12345 Время, мин.

Фиг.2

Таблица 4

234 Время, мин.

Фиг.З