СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВИТАМИНА В В БИОЛОГИЧЕСКОМ МАТЕРИАЛЕ Российский патент 1997 года по МПК G01N33/82 

Изобретение относится к химическим методам определения водорастворимых витаминов, определению содержания витамина B₅ (никотиновая кислота) в премиксах.

Известен способ определения витамина B₆, основанный на свойстве витамина при взаимодействии с бромистым роданом образовывать соединения, которые в присутствии ароматических аминов (анилин, метол) в нейтральной или слабокислой среде дают производные, окрашенные в желтый цвет. Оптическая плотность раствора измеряется на фотоэлектроколориметре на длине волны 440 нм. Интенсивность окраски прямопропорциональна количеству витамина B₅ [1, 2] Особенностью этого метода является относительно высокая скорость реакции и в связи с этим необходимость очень быстрого выполнения смещения испытуемых растворов с родано-бромидным раствором при том, что общая длительность анализа составляет около 3 ч. Кроме этого, реакция, лежащая в основе метода, не отличается высокой чувствительностью. Выше указанное является существенным недостатком данного метода, затрудняющим его практическое использование.

Известны также хроматографические способы определения витамина B₅ в различных биологических объектах [3-6] Наиболее близким по технической сущности к предполагаемому изобретению является способ определения содержания витамина B₅ в рисе и хлебных злаках [3] заключающийся в извлечении витамина B₅ в ходе гидролиза и хроматографическом анализе полученного гидролизата.

Гидролиз ведется 2н. раствором H₂SO₄ при 112^oC в течение 1 ч. Полученную суспензию фильтруют через фильтр 0,6 мкм, очищают и хроматографируют. Очистка гидролизата проводится при помощи анионнобменной смолы и окислителя пермангоната калия. В качестве сорбента используют Нуклеосил 5C18 (колонка 150 х 4 мм), элюент представляет собой 0,1 М раствор уксусной кислоты (pH 3). Детектирование ведется в ультразвуковой области спектра на длине волны 254 нм. Длительность анализа составляет 2-2,5 ч.

Однако известный способ имеет следующие недостатки:
процесс очистки гидролизата предполагает наличие специальных анионобменных колонок;
использование указанного элюента не позволяет эффективно разделять сложные смеси.

Целью заявляемого изобретения является упрощение, сокращение длительности анализа, а также повышение точности определения витамина B₅.

Поставленная цель достигается тем, что в предлагаемом способе определения витамина B₅ в отрубях (пшеничных) и премиксах, заключающемся в извлечении витамина и анализе полученного гидролизата методом жидкостной хроматографии, гидролиз ведут при температуре 121^oC в течение 30 мин в 2н. растворе H₂SO₄, а полученный гидролизат подвергают щелочной депротеинизации и после нейтрализации раствор анализируют на жидкостном хроматографе с использованием сорбента Силасорб SPH C18 и элюента уксусная кислота, триметиламин и вода, причем в качестве триметиламина использован его 25%-ный водный раствор, при объемном соотношении: уксусная кислота - триметиламин вода 3:2: 95.

Сопоставительный анализ с прототипом позволяет сделать вывод, что заявляемый способ определения содержания витамина B₅ отличается от известного тем, что гидролиз ведут 2н. раствором H₂SO₄ в течение 30 мин, очистку (осаждение протеинов) гидролизата ведут 40%-ным раствором NaOH, а в процессе хроматографического анализа используют в качестве сорбента Силасорб SPH C18 и элюент следующего состава: уксусная кислота триметиламин вода. Таким образом, заявляемый способ соответствует критерию "новизна".

Сравнение с другими техническими решениями в данной области техники не позволило выявить в них признаки, отличающие заявляемое решение от прототипа, что позволяет сделать вывод о соответствии критерию изобретения "изобретательский уровень".

На фиг. 1 приведена хроматограмма раствора витамина B₅ (никотиновая кислота фармакопейная) после соответствующей обработки.

На фиг. 2 и 3 показаны соответственно хроматограммы гидролизатов отрубей и премикса.

Способ определения витамина B₅ в отрубях и премиксах осуществляется следующим образом.

Пример 1. Объект исследования отруби пшеничные (далее отруби).

Навеску отрубей массой 2 г (с погрешностью не более 0,0001 г) вносят в коническую колбу вместимостью 100 см³. В цилиндр 50 см³ наливают 50 см³ 2н. раствора серной кислоты и переносят в коническую колбу с навеской отрубей, омывая при этом горлышко колбы. Содержимое колбы перемешивают, колбу закрывают ватно-марлевой пробкой и надевают сверху колпачок из бумаги для предотвращения намокания пробки при автоклавировании. Затем колбу помещают в автоклав на 30 мин при 121^oC. После автоклавирования колбу вынимают, охлаждают до комнатной температуры и фильтруют содержимое через бумажный складочный фильтр "синяя лента" в стакан вместимостью 200 см³. Осадок на фильтре промывают два раза дистиллированной водой порциями по 10 см³. К полученному фильтрату добавляют 2-3 капли 1%-ного спиртового раствора фенолфталеина, затем добавляют 40%-ный раствор NaOH до получения слабо-розового окрашивания, избыток щелочи нейтрализуют 25%-ным раствором серной кислотой, добавляя ее по каплям (до исчезновения розового окрашивания). Раствор фильтруют через складочный фильтр "синяя лента" в мерную колбу вместимостью 200 см³ и доводят до метки дистиллированной водой. Подготовленный таким образом гидролизат анализируют хроматографически.

Полученный гидролизат хроматографируют на жидкостном хроматографе "Милихром-2". Используется колонка 2 х 80 мм, заполненная Силасорбом SPH C18. В качестве элюента выбрана смесь уксусная кислота триметиламин вода 3: 2: 95. Измерения проводились с применением УФ-детектора на длине волны 260 нм. Объем пробы для анализа составляет 6 мкл, скорость подачи элюента через колонку 100 мкл/мин.

Время, затрачиваемое на анализ, включая гидролиз, составляет 1,5 ч. Хроматограмма гидролизата отрубей приведена на фиг.2.

Содержание витамина B₅ в анализируемом гидролизате определяют по градуировочному графику, который строится в координатах "высота хроматографического пика содержание витамина B₅". Для построения градуировачного графика хроматографируют 5 стандартных раствора витамина B₅, подготовленных по аналогии с гидролизатом отрубей.

В коническую колбу вместимостью 200 см³ взвешивают 0,1 г фармакопейного препарата витамина B₅, добавляют 50 см³ 2н. раствора серной кислоты. Колбу закрывают ватно-марлевой пробкой и надевают сверху колпачок из бумаги. Затем колбу помещают в автоклав на 30 мин при 121^oC. После автоклавирования колбу вынимают, охлаждают до комнатной температуры, количественно переносят в химический стакан объемом 150 см³, добавляют 1-2 капли 1%-ного спиртового раствора фенолфталеина. Затем к полученному раствору добавляют 40%-ный раствор NaOH до получения слабо-розового окрашивания, избыток щелочи нейтрализуют 25% -ным раствором H₂SO₄, добавляя ее по каплям (до исчезновения розового окрашивания). Раствор фильтруют через бумажный складчатый фильтр "синяя лента" в мерную колбу вместимостью 200 см³ и доводят до метки дистиллированной водой. Полученный стандартный раствор витамина B₅ имеет концентрацию 0,5 мг/см³. Из основного стандартного раствора витамина B₅ готовят градуировачные растворы разбавлением. Хроматограмма обработанного таким образом градуировачного раствора витамина B₅ представлена на фиг.1
На хроматограмме гидролизата отрубей (фиг.2) измеряют высоту пика, а затем по градуировачному графику определяют содержание витамина B₅ в анализируемом гидролизате.

Для расчета содержания витамина B₅ в отрубях используется формула:

где X содержание витамина B₅ в анализируемом образце, мг/г;
содержание витамина B₅ в гидролизате, определенное по градуировачному графику, мг;
m навеска отрубей, г.

Пример 2. Объект исследования премикс.

Навеску премикса массой 1 г (с погрешностью не более 0,0001 г) вносят в коническую колбу вместимостью 100 см³. В цилиндр наливают 50 см³ 2н. раствора серной кислоты и переносят в коническую колбу с навеской премикса, омывая при этом горлышко колбы. Содержимое колбы перемешивают, колбу закрывают ватно-марлевой пробкой и помещают в автоклав на 30 мин при 121^oC. После автоклавирования колбу вынимают, охлаждают до комнатной температуры и фильтруют содержимое через бумажный складчатый фильтр "синяя лента" в стакан вместимостью 200 см³. Осадок на фильтре промывают два раза дистиллированной водой порциями по 10 см³. К полученному фильтрату добавляют 2-3 капли 1%-ного спиртового раствора фенолфталеина, затем добавляют 40%-ный раствор NaOH до получения слабо-розового окрашивания, избыток щелочи нейтрализуют 25%-ным раствором серной кислоты, добавляя ее по каплям (до исчезновения розового окрашивания). Раствор фильтруют через складчатый фильтр "синяя лента". В мерную колбу вместимостью 200 см³ и доводят до метки дистиллированной водой. Подготовленный таким образом гидролизат анализируют хроматографически. Хроматограмма нейтрализата премикса приведена на фиг.3. Обработка полученных результатов и расчет содержания витамина B₅ в премиксе выполняется так, как описано в примере 1.

В табл. 1 приведены данные, позволяющие оценить точность определения витамина B₅ в отрубях и премиксах.

Для этого в лабораторных условиях готовились премиксы с точно известным содержанием витамина B₅, которое затем определялось так, как описано в примере 2. Премиксы готовились на основе отрубей.

Из данных табл.1 следует, что относительное отклонение отдельного определения не превышает 10,1% Причем расхождение между параллельными определениями не превышает 4 5 отн. Согласно ОСТ 59-20-77 "Премиксы для сельскохозяйственных животных и птицы" эта величина составляет 10 отн.

С целью оптимизации условий гидролиза отрубей и премиксов проводились специальные исследования влияния концентрации серной кислоты, температуры и длительности гидролиза на полноту извлечения витамина B₅.

В табл. 2 представлены результаты исследования влияния концентрации серной кислоты на эффективность извлечения витамина B₅ из премиксов при условии, что гидролиз ведется в автоклаве при 121^oC в течение 30 мин.

Как видно из полученных данных, наиболее полное извлечение витамина B₅ проходит при использовании 2н. раствора H₂SO₄. Для 1 н. раствора H₂SO₄ погрешность весьма существенна, т.е. извлекается только 80,0% витамина B₅, еще меньше степень извлечения витамина B₅ 0,5н. раствором H₂SO₄.

При использовании 3н. раствора H₂SO₄ происходит деструкция компонентов, извлекаемых из премиксов, раствор гидролиза чернеет и анализу не подвергается.

В табл. 3 приведены данные по влиянию температуры и длительности гидролиза премиксов соответственно 1 н. и 2н. растворами H₂SO₄.

Как видно из данных табл.3 эффективное извлечение витамина B₅ возможно при использовании 1н. раствора H₂SO₄ и длительности гидролиза 1 ч или 2н. раствора H₂SO₄ но длительности гидролиза 30 мин. При проведении гидролиза при температуре 100^oC (водяная баня) погрешность определения витамина значительна и составляет не менее 17,2% При этом получаемая суспензия очень плохо фильтруется, так как представляет собой концентрированную коллоидную систему. После проведения гидролиза гидролизат отделяют от твердой фазы путем фильтрации. Для осаждения протеинов к гидрализату добавляют 40%-ный раствор NaOH и после нейтрализации избытка NaOH раствор вновь фильтруют. Как показали исследования такой способ очистки гидролизата в сочетании с предложенным сорбентом и элюентом для хроматографирования обеспечивает высокую эффективность определения витамина B₅ в премиксах. Причем в гидролизате, полученном при автоклавировании, примесей содержится меньше, чем при использовании водяной бани, это позволяет сократить время хроматографического анализа.

Использование предлагаемого способа по сравнению с прототипом позволяет на 1 ч уменьшить продолжительность анализа и повысить точность анализа в 1,5 раза за счет сокращения количества операций (с 5 до 3), что способствует уменьшению потерь исследуемого образца.

Источники информации
1. Определение витаминов в биологических материалах и кормах. Методические указания. Львов, 1978.

2. ОСТ 59-20-77 "Премиксы для сельскохозяйственных животных и птицы". Глав. Упр. Микробиолог. пром-сти при СовМин СССР, М. 1977.

3. Критический обзор методов ВЭЖХ для определения тиамина, рибофлавина и ниацина в пище. Finglas P.M. Faulks R.M. //Critikal review of KPLC methods for the determination of thiamin, riboflawin and niacin in Food Journfl of Micronutrient Analysis. 1987. N 3, с. 251-283.

4. РЖ Хим. 1985. N 13 P 66. Сравнение микробиологического и метода ВЭЖХ для определения тиамина в пищевых продуктах. Comparison of a high -petformance ligwid chromatographic and microbiological method for the determination of niacinin food. /Van Niekerk Pieeeter J. Smit Salomien C.C. Strydom Emmerentia S. P. Armbruster Gurli.// J. Arg. and Food Chem. 1984. 32, N 2, с. 304-307.

5. РЖ Хим. 1990. N 22. реф. 22Г353. с. 47. Экспрессное и одновременное определение водорастворимых витаминов, кофеина и консервирующих добавок в тониках при помощи высокоэффективной жидкостной хроматографии с образованием пар ионов. Malda Y. Owada K. Yamamota M.// Иякухик кэнкю. 1990. v.21. N 3. с. 444-448.

6. РЖ Хим. 1983. N 14. реф. 14Г259. Определение никотиновой кислоты в фруктовых соках с помощью высокоэффиктивной жидкостной хроматографии с электрохимическим детектированием с применением стандартного капающего ртутного электрода. Bestimmung von Nicotinsaure in Fruchtsalten obirch HPLC mit electrochemischer Detektion an einer stationaren Quecksilbertropfeletrode./ Kral Kral.// Fresenius Z. Anal. Chem. 1983. v. 314. N 5. c. 497-482.

Использование: биотехнология, биохимия. Сущность изобретения: для определения витамина B₅ исследуемый материал подвергают кислотному гидролизу 1-2 н. H₂SO₄, полученный гидролизат депротеинизируют и затем хроматографируют на сорбенте Силасорб SPH C18, а элюцию витамина осуществляют смесью уксусная кислота : 25%-ный водный раствор триметиламина : вода при объемном соотношении 3:2:95. 3 ил., 3 табл.

Способ определения витамина B₅ в биологическом материале, включающий выделение витамина B₅ из исследуемого материала путем кислотного гидролиза при 121^oС, фильтрования гидролизата, хроматографирования на сорбенте с последующей спектрофотометрией, отличающийся тем, что гидролиз проводят 1 2 н. H₂SO₄ в течение 30 60 мин, гидролизат депротеинизируют, в качестве сорбента используют Силасорб SРН С 18, а элюцию витамина B₅ проводят смесью уксусная кислота 25%-ный водный раствор триметиламина вода при объемном соотношении 3 2 95.