Способ диагностики болезни Марека Советский патент 1993 года по МПК C12N7/00 G01N33/48 

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии и может быть использовано в птицеводстве.. .

Болезнь Марека кур - высококонтагиозное заболевание, вызываемое вирусом герпеса группы В, характеризующееся развитием лимфоидных опухолей внутренних органов и лимфоидной инфильтрацией периферических нервов.

Известны способы диагностики болезни Марека на основании клинико-эпизоото- логичёских данных, патологознатомических и гистологических изменений, результатов вирусологических исследований.

Клинико-эпизоотологическими проявлениями болезни Марека считают поражения периферической и центральной нервной системы птицы, сопровождающиеся хромотой, парезами и параличами ног, крыльев, шеи, поражения кожи, проявляющиеся в виде утолщенных фолликулов перьев, диффузно опухолевидных утолщений кожи, частично с некрозами, поражения глаз в виде деформации зрачка с изменением цвета радужной оболочки или без такового. Однако появление этих признаков

зависит от степени поражения нервной системы.

Патолргогистологические изменения при болезни Марека развиваются раньше, чем проявляются внешние симптомы болезни и характеризуются лимфоидно-клеточ- ной инфильтрацией пораженных органов и тканей. В периферических нервах находят отечность, диффузно-очаговую лимфоидно- клеточную инфильтрацию нервного ствола и его соединительнотканной оболочки, а также периаксональную демиелинизацию нер- вных волокон от которой зависит неврологическая симптоматика болезни.

Однако патологогистологические исследования трудоемки и, кроме того, требуют убоя птицы, что увеличивает стоимость диагностики.

Процедура вирусологического способа диагностики болезни Марека, включающая в се.бя биопробу на цыплятах, куриных эмбрионах и культуре клеток, выделение и идентификацию вируса, а также идентификацию антител у больной и переболевшей птицы посредством постановки реакции диффузной преципитации (РДП), длительна, требуСО

С

44 О

N СЛ 4Ьь

ет значительных затрат животных и материалов.

Известен способ диагностики ранних стадий болезни Марека кур, включающий введение в сережку внутрикожно основного белка миелина, считывание через 18-24 ч кожно-аллергмческой реакции, а также гистологическое подтверждение диагноза.

Однако данный способ диагностики сопряжен для птиц со стрессами, возникающими при неоднократном взятии их в руки, введений аллергена в сережку, а также при отрезании кусочков сережек для гистологических исследований.

Целью изобретения является уменьшение трудозатрат и снижение стрессового воздействия на птицу при прижизненной диагностике болезни Марека кур, повышение эффективности диагностики и улучшения, за счет этого, эпизоотической обстановки в птицехозяйстве.

Это достигается тем, что для оценки эпизоотической обстановки в птицехозяйстве от птицы берут из подкрыльцовой вены 0,5 мл крови и исследуют на наличие антител к основному белку миелина. Положительная реакция свидетельствует о заболевании болезнью Марека.

Пример. При подозрении на болезнь Марека или для оценки эпизоотической обстановки от птицы берут 0,5 мл. крови из подкрыльцовой вены, отделяют сыворотку и исследуют ее посредством проведения им- муноферментного анализа, включающего следующие этапы.

1. Специфический антиген (основной белок миелина) сорбируют на поверхности полистироловой панели. С этой целью в лунки 9б-луночной панели вносят по 0,1 мл рабочего раствора основного белка миелина (в разведении 1:20), инкубируют в течение 2 часов при 37°С или 16-18 часов при 4°С. После чего удаляют несорбированный основной белок миелина и лунки 4-5 раз про- мывают 0,01М фосфатно-буферным раствором (рН 7,2-7,4), содержащим 0,05% твина-20 и 0,5 М хлорида натрия. После каждой промывки перевернутые панели просушивают постукиванием по фильтровальной бумаге.

2. В каждую лунку вносят по 0,1 мл исследуемой сыворотки в разведении 1:50 на промывочном буферном растворе. При этом -антитела, находящиеся в пробах, связываются с антигеном (основным белком миели- на). На исследование одной пробы используют две лунки. На одной 96-луноч- ной панели можно исследовать 45 проб. Ос- тавшиеся 6 лунок используют для контролей: в две лунки вносят по 0,1 мл

положительной сыворотки, в две лунки - по 0,1 мл отрицательной сыворотки, в лунку, предназначенную для контроля конъюгата, последовательно вносят все ингредиенты

реакции, кроме сыворотки, вместо которой добавляют 0,1 мл промывочного буфера. В лунку, предназначенную для контроля субстрата взамен всех ингредиентов реакции, исключая субстрат, вносят по 0,1 мл промы0 вочного буфера, субстрат вносят в таком же количестве. Внесенные в лунки исследуемые и контрольные пробы инкубируют 1,5 часа при 37°С. Затем панели промывают 4-5 и высушивают (п. 1).

5 3, В лунки панели, за исключением лунки контроль субстрата вносят по 0,1 мл раствора конъюгата (специфические антитела (антивидовые), меченые пероксидазой), разведенного промывочным буфером до

0 указанного рабочего разведения, который связывается с антителами.

Пробы инкубируют 1,5 часа при 37°С. По окончании инкубации панели промывают 4- 5 раз и высушивают,

5 4. В лунки панели вносят по 0,1 мл свежеприготовленного субстрата (0,8 мг/мл 5- аминосалицилрвой кислоты с содержанием 0,005% перекиси водорода - рН 6,0-6,2). Панель с пробами оставляют на 30-40 мин

0 в темном месте, после чего учитывают результаты реакции.

Результаты учитывают спектрофотомёт- рически при длине волны 450 нм, а при отсутствии .спектрофотометра - визуально.

5 При визуальной оценке результатов окраску исследуемых проб сравнивают с окраской положительного и отрицательного стандартов.

Учет реакции проводят по 4-х крестовой

0 системе:

++++ - темно-коричневое окрашивание; +++ - коричневое окрашивание: ++ - светло-коричневое окрашивание; + - желтое окрашивание;

5 - - окрашивание отсутствует.

Ответ считают положительным, если окраска раствора в лунке с исследуемым образцом соответствует + и выше.

За титр сыворотки принимают макси0 мальное ее разведение, которое еще обеспечивает окраску продукта пероксидазной реакции в 2.1 раза превышает экстин- цию (оптическую плотность) раствора в лунках с отрицательной сывороткой.

5 Растворы в лунках с отрицательной сывороткой, контроль субстрата контроль конъюгата должны быть неокрашены. Интенсивность окраски в лунке с положительной сывороткой должна соответствовать ++++,

П р и м е р 2. При подозрении на болезнь Марека или для оценки эпизоотической обстановки от птицы берут 0,5 мл крови из подкрыльцовой вены, отделяют сыворотку и исследуют ее по месту флуоресцирующих антител. Исследование включает в себя три этапа.

1. Специфический антиген (основной белок миелина) сорбируют на чистое, предварительно обезжиренное предметное стекло, не имеющее царапин. С этой целью наносят по 3 капли (по 20 мкл каждая) рабочего раствора основного белка миелина в концентрации 1-2 мг/мл, разведенном на 0.01М фосфатно-буферном растворе (рН 7,2). приготовленном на 0.15М растворе хлорида натрия. На предметном стекле делают 3 мазка диаметром 1,0-1,5 см и высушивают их при комнатной температуре.

2. На каждый из мазков основного белка миелина наносят по капле исследуемой куриной сыворотки в разведении 1:4 на фосфатно-буферном растворе и помещают их во влажную камеру на 30 мин при 37°С. Затем мазки.дважды отмывают фосфатно- буферным раствором по 10 мин и подсушивают при комнатной температуре.

3. На подсушенные мазки наносят по 20 мкл коньюгата - коммерческого (производства Института эпидемиологии и микробиологии им. Гамалеи АМН СССР) антивидового гамма-глобулина, меченого ФФИТЦ, в рабочем разведении, указанном на этикетке. Препараты инкубируют во влажной камере при37°С в течение 30 мин, отмывают 3 раза по. 5 мин фосфатно-буферным раствором, ополаскивают дистиллированной водой и после подсушивания на воздухе просматривают под люминесцентным микроскопом с использованием нелюминисцирующего им- мерсионного масла или диметилфталата. В микроскопе при этом используют первичные фильтры типа СС-4, СС-8, СЗС-7 в комбинации с запирающим светофильтром типа НС-18. Микроскопию окрашенных препаратов проводят в отраженных лучах, падающих на объект, сверху, через объектив микроскопа.

Контролями специфичности при исследовании препаратов на наличие антител к основному белку миелина служат:

- положительные препараты, обработанные нормальной сывороткой в различных разведениях;

- положительные препараты, обработанные люминесцирующим антивидовым конъюгатом без иммунной немеченной сыворотки;

- за специфическое принимают ярко-зеленое свечение миелиновых волокон в виде мелких гранул различной формы.

В контрольных препаратах специфиче- 5 екая зеленая флуоресценция должна полностью отсутствовать.

Интенсивность специфического свечения в препарате оценивают по четырехбалльной системе:

0 ++++ - ярко изумрудно-зеленое свечение;

+++ - яркое зеленое свечение;

++ - слабое зеленое свечение;

+ - слабое зеленовато-желтое свечение. 5 Положительным результатом, свидетельствующим о заболевании болезнью Марека, считают наличие в препарате волокон основного белка миелина с интенсивностью свечения 4 или 3 креста в 3-5 полях зрения. 0 П р и м е р 3. При подозрении на болезнь Марека или для оценки эпизоотической обстановки от птицы берут 0,5 мл крови из подкрыльцовой вены, отделяют сыворотку и исследуют ее посредством реакции агглю- 5 тинации латекса, включающей следующие этапы.

1. Специфический антиген (основной белок миелина) сорбируют на поверхность полистиролового латекса. С этой целью бе0 рут 5 частей основного белка миелина в кон- центрации 16 мг/мл, разведенного глициновым буферным раствором (рН 8,8) и соединяют с 1 частью 10% отечественного карбоксилсодержащего полистиролового

5 латекса с диаметром частиц 0,8 мкм. Сенсибилизацию смеси латекс-антиген проводят в течение 2-х часов в термостате при 37°С.

По истечении этого срока сенсибилизи0 рованный латекс осаждают центрифугированием в течение 10 мин при 3000 об/мин и ресуспендируют в этом же буферном растворе в виде 1% суспензии.

2. Исследуемые сыворотки прогревают 5 в течение 20 минут при 60°С или 30 минут при 56°С. Затем их разводят глициновым буферным раствором до рабочего разведения 1:4. Каплю (0,025 мл) разведенной сыворотки наносят на полистироловую 0 пластинку и к ней добавляют в равном обът еме суспензию сенсибилизированного латекса. Пластинку встряхивают вручную в течение 2 минут или на такой же срок помещают на вращательный столик. Реакцию 5 учитывают через 5-15 мин. При наличии в сыворотке гомологического иммунного ком- . понента (антител к основному белку миелина) склеивающиеся частицы латекса образуют агглютинат. хорошо видимый невооруженным глазом. При отрицательных

результатах реакции суспензия латекса остается гомогенно мутной, без глыбок агглю- тината и участков просветления.

Учет реакции агглютинации латекса проводят по 3-х балльной системе:

+++- резкоположительная реакция: четкая агглютинация, крупные хлопья в прозрачной жидкости;

++ - положительная реакция: четко видимая агглютинация, однако фонд полно- стью не просветляется;

--отрицательная реакция: жидкость остается гомогенно мутной.

Контролем реакции агглютинации латекса служат.........

исследуемая куриная сыворотка в исходном разведении (1:4) + суспензия несин- сибилизированного латекса (отрицательная реакция); нормальная куриная сыворотка, не содержагцая антител к основному белку миелина + суспензия сенсибилизированного латекса: (проверка специфичности диаг- ностикумэ); сыворотка от птицы с болезнью Марека (гомологичная сыворотка) + суспензия сенсибилизированного латекса (провер- ка активности диагностикума.

П р и м е р 4. При подозрении на болезнь Марека или для оценки эпизоотической обстановки от птицы берут 0,5 мл крови из подкрыльцовой вены, отделяют сыворотку и исследуют ее посредством тонкослойного иммунного анализа, включающего следующие этапы.

1. Специфический антиген (основной белок миелина) сорбируют на поверхности полиетирловой чашки Петри диаметром 40 мм, предварительно обработанной этано- лом. Для этого на поверхность чашки вносят 2 мл рабочего раствора основного белка миелина в концентрации 1-4 мг/мл, приготов- ленного на калий-фосфатном буферном растворе (рН 7,2-7,4). Антиген инкубируют при 37°С в течение 1 часа или при 4°С - 16-18 часов. После чего удаляют избыток антигена, а поверхность чашек 2-3 раза промывают калий-фосфатным буферным раствором и высушивают при комнатной температуре. При этом один и тот же раствор антигена можно использовать 4-6 раз. Сенсибилизированные чашки Петри хранят до использования во влажной камере при 4°С. .

2. На сенсибилизированную основным белком миелина поверхность чашки вносят по 0,025 мл исследуемых сывороток в разве- дении 1:4 на калий-фосфатном.буферном растворе.

На каждой из двух крышек чашки Петри можно исследовать 20-30 проб (каждая проба обводится шариковой ручкой),

3, Высушенную чашку устанавливают на 1 мин в перевернутом виде над водяной баней с температурой воды 56°С,

Результаты реакции учитывают визуально, оценивая характер образующегося конденсата. Конденсат, образующийся на участках, покрытых комплексами антиген- антитело имеет вид крупных капель диаметром 2-4 мм, а на необработанных участках и на обработанных нормальной или даже иммунной сывороткой - мелких капель диаметром 0,5-1,0 мм,

П р и м е р 5.

1. По п.1 примера 3.

2. На поверхность чашки Петри вносят 2-3 мл расплавленного 1% агара (темп. 50- 56°С), приготовленного на 0,15 М растворе хлорида натрия с добавлением 1 % лошадиной сыворотки. После застывания агара в нем пробойником вырезают лунки диаметром 3-4 мм в которые вносят исследуемые сыворотки и контрольные сыворотки (нормальную сыворотку и сыворотку от птицы, больной болезнью Марека) по 0,025 мл в каждую лунку. Чашку оставляют на 24 часа при комнатной температуре для диффузии сывороток, после чего агар удаляют, чашку промывают калий-фосфатным буферным раствором.

3. Высушенную чашку устанавливают на 1 мин в перевернутом виде над водяной баней с температурой воды 56°С.

Результаты реакции .оценивают визуально по характеру образующегося конденсата или по диаметру зоны крупнокабельного конденсата, т.к. эти величины прямо пропорциональны концентрации антител в исследуемом материале, Например, при содержании в исследуемой жидкости 1 /4 мкг/мл антител диаметр соответствующей зоны составлял 4 мм, при 22 мкг/мл - 8 мм, 87,5 мгк/мл - 12 мм.

Использование предложенного в качестве изобретения способа прижизненной диагностики болезни Марека кур позволяет оперативно, до развития клинико-эпизоото- логических признаков, проводить диагностику заболевания. При этом отпадает необходимость в.проведении диагностики по способу, основанному на считывании кожно-аллергической реакции, который из- за неполного выявления больной птицы применим только для групповой диагностики, снижаются трудозатраты на осуществление диагностики и стрессовое воздействие на птицу. За счет указанного выше повышается эффективность диагностики и улучшается эпизоотическая обстановка в птицехозяйстве.

91791454 10

Формула изобретенияцелью упрощения и ускорения способа, в

Способ диагностики болезни Марекакачестве иммунологической пробы испольпутем постановки иммунологической пробызуют определение антител к основному белна миелин, отличающийся тем, что, ску миелина в сыворотке крови.

Использование: ветеринарная вирусология. Сущность изобретения: для оценки эпизоотической обстановки в птицехозяйст- вах от птицы берут из подкрыльцовой вены кровь и исследуют на наличие антител к основному белку миелина. Положительная реакция свидетельствует о заболевании болезнью Марека.