Способ отбора сырья для получения антилептоспирозной плазмы Советский патент 1993 года по МПК A61K39/40 

: Изобретение относится к области ме-. дмцины, а именно, к способам получения иммунных препаратов из крови человека, и гложет быть использовано в производствен- н1ой трансфузиологии.

t Лептоспироз является инфекционным заболеванием, характеризующимся тяже- л ым течением, летальность при котором в Некоторых регионах мира достигает 48%.

В комплексном лечении больных леп- тоспирозом применяется плазма человеческая нормальная и ксеногенный Йммуноглобулин, полученный из крови ги- Мериммунизированных волов.

В основе способов получения этих препаратов лежит либо скринирование исход- йых сывороток крови, либо активная иммунизация доноров крови соответствующими вакцинами или анатоксинами. Последний способ трудоемок, требует наличия

коммерческих вакцинных препаратов и организации многочисленного контингента доноров-добровольцев для проведения специфической иммунизации.

Задачей изобретения является получение аллогенного антилептоспирозного препарата с высокой специфической активностью и стабильностью.

Способ осуществляется следующим об- разом.

Готовят лептоспирозный поливалентный эритроцитарный диагностикум повышенной чувствительности, с его помощью проводят скрининг индивидуальных образцов сыворотки крови здоровых лиц в реакции пассивной гемагглютинации для выявления антилептоспирозных антител. Кровь доноров, в сыворотке которых выявлены антитела в титрах 1:160 и выше, является источником получения аллогенной

ю -ч о ю

антилептоспирозной. плазмы в жидкой, замороженной илиофилизировэнной формах.

П р и м е р 1. Готовят лептоспирозный поливалентный эритроцитарный диагности- кум повышенной чувствительности из ряда штаммов лептоспир, обладающих подвижностью, типичной морфологией, хорошим ростом на питательной среде, агглютинирующихся тмпоспецифической иммунной сывороткой до титра не менее чем 1:10000.

Для получения бактериальной массы маточную культуру каждого штамма засевают во флаконы со средой Терских в соотношении 1:10 и выращивают при в течении 10-14 дней. Примеси белка питательной среды удаляют центрифугированием через четырехслойный марлевый фильтр. Взвесь бактерий центрифугируют.при 6000 об/мин в течении 40 мин при 80 ± 2°С. Биомассу ресуспендируют в 0,9% растворе натрия хлорида до конечной концентрации 50 ± 10 мг/мл. Рабочую взвесь клеток каждого штамма в объеме 50 мл для выделения антигена озвучивают в аппарате УЗДН-1 в следующем режиме: частота 44 -кГц, сила тока 0,7-0,8 Ма, продолжительность озвучивания 3 ± Т мин, температура 15 ± 3°С. После озвучивания взвесь центрифугируют при 6000 об/мин в течении 40 мин при 8 ±2°С. Из раствора .каждого моноантигена отбирают пробу в объеме 3 мл для определения сенсибилизирующей активности.

Сенсибилизирующую активность антигена проверяют в дозах 0,01 мг/мл - 0,05 мг/мл путем сенсибилизации ими та- низированных формалинизированных эритроцитов барана. Антиген считают годным, если сенсибилизирующая активность .не превышает 0,05 мг/мл взвеси 2,5 % эритро- . цитов.

, Моноантигены штаммов объединяют в пблиантиген в объемах обратно пропорциональных их гомосенсибилизирующей активности, Общий объем в дальнейшем именуемый серией должен быть не менее 100мл.: .

Серию поливалентного антигена разливают в стерильные пробирки по 5 мл, закры-. вают резиновыми пробками и сохраняют Т1ри -20°С. Срок хранения антигена - б месяцев.

Необходимое для приготовления диаг- ностикума количество формалинизированных 10% эритроцитов барана отбирают в пробирки по 2 мл. Осаждают и отмывают 4-кратным центрифугированием при 1000 об/мин в течении 15 мин от остатков формалина раствором нормальной кроличьей сыворотки 1:250 в 0,9% растворе натрия хлорида рН. 6,8 ± 0,05. Эритроциты разводят до концентрации 2,5% взвеси 0,9% раствором натрия хлорида рН 6,8 ± 0,05, прогретым при 37°С.

К 2,5% взвеси отмытых формализированных эритроцитов, постоянно помешивая, добавляют равный объем танина

1:20000, предварительно подогрев его до

37°С. Танизацию проводят при 37°С ± 1°С

.в течении 15 минут. По окончании таниза- ции взвесь эритроцитов трехкратно отмывают забуференным 0,9% раствором натрия хлорида рН 6,4 ±0,05, центрифугируя по 10 мин, при 1000 об/мин. Осадок после центрифугирования разводят этим же забуференным раствором до 2,5% концентрации эритроцитов.

К 2,5% взвеси танизированных эритроцитов при перемешивании добавляют равный объем раствора лептоспирозного антигена в оптимальной сенсибилизирующей дозе, выдерживают при 45° ± 1 ° 60 мин на водяной бане.

К смеси формалинизированных эритроцитов с сенситином для более прочного связывания лептоспирозногр антигена с рецепторами эритроцитов добавляют формалин до 1,0% конечной концентрации за 15 мин до конца сенсибилизации.

Взвесь сенсибилизированных эритроцитов осаждают центрифугированием при 1000 об/мин в течение 15 мин. Остатки сен- ситина, не связывающегося с рецепторами эритроцитов, удаляют 4-кратным отмыванием на центрифуге в том же режиме рас: твбром нормальной кроличьей сыворотки из расчета 25-кратного объема к осадку эритроцитов.

Осадок сенсибилизированных эритроцитов после отмывания разводят до 5,0% концентрации эритроцитов раствором нормальной кроличьей сыворотки в разведении 1:250. Готовый жидкий диагностикум консервируют добавлением формалина до конечной концентрации 2,0%.

Образец плазмы крови донора исследуют на наличие антилептоспирозных антител в реакции пассивной гемагглютинации. Титр выявленных в образце плазмы антилептоспирозных антител составляет 1:160. В реакции с цистеином установлено, что аитилептоспирйзныё антитела относятся к иммуноглобулинам класса G. Плазму крови данного донора подвергают лиофильному высушиванию.

П р и м е р 2, Готовят лептоспирозный эритроцитарный диагностикум повышенной чувствительности способом, описанным в примере 1. Образец плазмы крови

4онорд исследуют на наличие антилептос- Нирозных антител в реакции пассивной ге- Дагглютинации.

I Титр выявленных антилептоспирозных Антител составляет 1:256. Плазму крови данного донора лиофильно высушивают.

I. П р и м е р 3. Лептоспирозный эрит- р оцитарный диагностикум повышенной Чувствительности и выявление антилептос- Нирозных антител проводят аналогично Примерам 1 и 2. Титр выявленных антилеп- тЬспирозных антител составляет 1:320. Плазму крови данного донора лиофильно вУсушивают.

I Протективное действие антилептоспи- ршной плазмы исследовали in vivo на мор- с ких свинках (табл.1), массой 190-200 г, которых предварительно заражали внутри- б рюшинно культурой лептоспир в дозе 21 108 клеток, относящейся к серогруппе

ibterohaemorrhagiae.

В результате проведенных исследований оказалось, что наибольшей про- т активной активностью обладала сухая ловеческая антилептоспирозная плазма.

0

Плазма крови с титром 1:160-1:320 ан- тилептоспирозных антител выявляется у здоровых лиц в 6% случаев. Плазма крови с титрами антилептоспирозных антител, уровень которых ниже, чем 1:160 не может считаться антилептоспирозной, т.к. она обладает низкой специфической активностью. Плазма крови с титром антилептоспирозных антител, превышающим 1:320, встречается крайне редко, поэтому ее отбор в качестве специфического препарата нереален.

Заявляемый способ позволил впервые получить аллогенную антилептоспирозную плазму в жидкой,замороженной и лиофили- зированной формах, характеризующихся уровнем титров антилептоспирозных антител 1:160-1:320, относящихся к иммуногло- булинам класса G, стабильно сохраняющую специфическую активность в жидкой форме- 72 часа при температуре 6-2°С; в замороженной форме - 6 месяцев при температуре -25 ± 5°С; в лиофилизированной форме - 2 года при температуре 20-2°С (табл.2).

Использование: медицина, аллоген- ный препарат, профилактика и лечение лептоспироза. Сущность изобретения: скринируют кровь практически здоровых донороспособных лиц для выявления высоких (1:160-1:320) антител к лёптоспирам, в реакции пассивной гемэгглютйнацми с леп- тоспирозным поливалентным эритроцитар- ным диагностикумом повышенной чувствительности. Полученная антилептос- пирозная плазма в л;иофилизированной форме обладает специфической активностью. 2 табл.

Формула изобретения Способ отбора сырья для получения ан- тплёптоспирозной плазмы путем скриниро- в жия крови людей, отли чающи и с я , что, с целью повышения активности и стабильности целевого продукта, проводят

Протективная эффективность антилептоспирозной плазмы

скринирование крови здоровых лиц с использованием лептоспирозного поливалентного эритроцитарного диагностикума и отбирают образцы плазмы с титром антилептоспирозных антител 1:160-1:320. относящихся к иммуноглобулинам класса G.

Т а бл и ц а 1

Таблиц а 2 Специфическая активность сухой антилептоспирозной плазмы в процессе хранения