Способ определения фракций уробилина в сыворотке крови Советский патент 1993 года по МПК G01N33/72 

/1зобретение относится к медицине, а име-tHO к исследованиям биологических жидкостей путем разделения фракуробили- на.и может быть использовано в лабораторной диагностике.

Проблема разделения фракций уробилина традиционного трудная. До настоящего времени нет экспрессного и простого метода разделения фракций.

К наиболее надежным и точным методам относят методы электрофореза с последующей обработкой лент хлорным железом или хлоридом ртути. Методы требуют специальной аппаратуры и занимают 48 ч рабочего времени.

Существует простой метод индикации, но выделяется одна фракция и требует специального аппаратурного обеспечения.

Существует метод индикации 1-уроби- лика в моче. Метод осуществляется путем длительного приготовления импрегниро- ванных особым составом лент, с его помп цью может быть осуществлена

индикация фракции только 1-уробилина и только в моче. .

За прототип предлагаемого изобретения взят способ, основанный на реакции окисления фракций уробилина хлорным железом. Он позволяет разделить фракции и, особенно, выделить фракцию D-уробилина, которая, как установлено авторами, несет особую информацию для цели дифференциальной диагностики, в то время как содержание ее мало, и это самая неустойчивая из всех фракций. Этим вызвана некоторая ее недооценка в клинической практике. К основным недостаткам методЗ следует отнести следующие: метод требует предварительного осаждения билирубина с последующей длительной экстракцией фракций хлороформом, его выпаривание; время реакции 2,5-3 ч; регистрация результатов требует специальной аппаратуры (спектрофотометр); для выполнения анализа требуется специалист средней или высшей квалификации.

Ё

VI

О

СА) W VI 00

Целью изобретения является упрощение и ускорение способа.

Поставленная цель достигается следующим способом; на фильтр из бумаги для электрофореза диаметром 25-30 мм, пропитанный 0,5 мл сыворотки крови в течение 10-15 мин, наносится 0,01 мм азотной кислоты желтого цвета от присутствия азотистой и по появлению на месте нанесения кислот бирюзовой окраски в первую минуту судят о присутствии D-фракции, riO появлению только пурпурной и фиолетовой окраски - 1-уробилйна, по появлению желтой - 1 -уробилина (стеркобилина), при развитии Окрасок: бирюзовая, за ней - кольцо пурпурной или фиолетовой с последующим появлением желтой (в центре) судят о присутствии всех трех фракций,--. ; : ,V ;;л- V ; V V:

Если на пропитанную биологической жидкостью фильтровальную бумагу (круг диаметромi25-30 мм) нанести 0,01 мл азотной кислот ц Ј присутствием азотистой, в пер- в;ыё же:30 с на фильтре появляются концен- тр ичёс:кие кольца различной окраски Авторы данной заявки впервые путем пара л л ё л ь нр; л р сведенного с п е кт ра л ь н Ь г о анализа установила, что каждому кольцу оп- :рёдёленной окраски соответствует опреде- лён на я фракция уробилина или стеркобилина ;; ..; , ;;. :

Первой в реакцию окисления вступает фракция D-уробилйна, как самая неустойчивая, и Дает кольцо-пятно лазурного цвета, соответствующее глаукобилину - конечно му продукту окисления фракции, если она присутствует в субстрате. Второй в реакцию вступает 1-уробилйн, если он присутствует, и даёт концентрическое кольцо пурпурно- сиреневого, фиолетового цвета, соответст- ;: вующее ййблинам. Кольца не смешиваются, т.к. на такой (бумаге идет постоянный форез от центра к периферии. Последним - через 1-2 мин в центре развивается желтое пятно - это стеркобилин; он не мигрирует, оставаясь е центре. При отсутствии первых двух фракций имеет место только желтое пятно стеркобилина с белым концентрическим кольцом вокруг. В сыворотке крови - это коагулировавший белок.

При высоком уровне 1-уробилина на 8- 10 мин реакции во внешнем круге появляется бирюзовый или лазурный цвет - это глаукобилин, полученный из виолинов при избытке окислителя или самого субстрата, На 15-20 мин может появиться сине-голубая окраска - это продукт окисления свободного билирубина. Чтобы этого избежать, ,авторами подобраны объем сыворотки, окислителя и диаметр фильтра. Для правильной оценки фракционного состава по

хроматограмме важно расшифровать ее в первые 5-6 мин. Первым в реакцию вступает 1-уробилин. Появление лазурной окраски во внешнем кольце после пурпурно-фиолетовой не свидетельствует о присутствии этой фракции, а характеризует высокий уровень 1-уробилина. :

Ранее подобная реакция использовалась в лабораторной диагностике при исследовании мочи на бйлирубин - проба Гмелина (Руководство по клиническим и лабораторным исследованиям. Медицина, М., 1960, стр.375). Возможность индикации фракций уробилина и стеркобилина с помощью этой реакции нигде не описана, что доказывает соответствие предлагаемого способа критерикэ существенные отличия.

Способ осуществляется следующим образом: в центре фильтра непроклеенной бумаги диаметром 25-30 мм на столике с уровнем (для равномерного пропитывания), находящимся в чашке Петри и предварительно смоченном дистиллированной водой, наносят 0,5 мл сыворотки крови.

Фильтр пропитывается ею 10-15 минут, после чего оставшаяся, не впитавшаяся сыворотка крови стряхивается о стенку чашки,

пропитавшийся таким образом фильтр помещается на стекло (на столике с уровнем) в

центр наносится капля азотной кислоты

желтого цвета от присутствия азотистой,

объем капли равен 0,01 мл. Азотная кислота в качестве окислителя вместо взята, как наиболее .сильный и практически бесцветный окислитель. Объем сыворотки, окислителя и диаметр фильтра подобраны экспериментально. Ниже приводятся результаты этих экспериментов. Для анализа выбрана непроклеенная бумага для электрофореза с характеристиками; масса 1 кв.м 245±15 г, толщина 44±3 мкм, капиллярная всасываемость при поперечном направле- ним 80±7 мм, впитываемость при погружении менее 2с. Все характеристики

приведены для воды. Приходится учитывать, что при анализе сыворотки крови, содержащей крупные молекулы биологических соединений, в частности пигменты - это целые цепи молекул упакованные в особые упаковки, чтобы бумага пропитывалась максимально, выбрано время 10-15 мин. По истечении этого времени обьем остаточной капли варьировал в пределах 0,02-0,15 мл, что зависело от состава сыворотки. При времени, меньшем 10 мин, разброс остаточной капли значительно больше (0,05-0.2).

Объем 0,01 м НМОз определен путем вычисления, т.к. допустимый уровень содержания фракций известен.

Концентрация 9-8,5 МНМОз соответствует концентрированной кислоте. Коммерческая

1,37кислота

.2

имеет

плотность

1,405 г/см и соответственно концентрацию 61-68%, пределы колебаний нор- малшостей при такой характеристике составляют 8,95-8,52. Авторы округлили это -8,5. Концентрация азотистой кислоты ределяется, поэтому указывается тольдо9нео ко ц

ет (желтая от присутствия азотистой). 1ыбранный обьем окислителя 0,01 мл, внесении его на фильтр, форезировал нтра на радиус 8 мм (диаметр круга до л) за 5 мин, на 6 мин этот круг начинал ться, улетучивалась вода. При нанесе- этого же объема кислоты на фильтр,

при от ц 16м суж

. НИИ

прогитанный дистиллированной, диаметр

круг

30м

уже

фил

кост

цен

Это

ми,

что i

НОВ

а этс то ч ИСТУ

i достигал 22 мм, в отдельных случаях м. Так как объем и концентрация были выбраны, то авторы остановились на тре с диаметром 25-30 мм. Три выборе объема исследуемой жид- 1 авторы исходили из следующего: кон- рация фракций уробилина очень низка, подтверждается имеющимися даннымл сыворотки крови в патологии могут максимально содержать 17,2 мкг фракции D-уробилина, минимально - 5,2 мкг. Соотвенно в 0,5 мл - 1,72 мкг и 0,52 мкг.

взять объем сыворотки меньше 0,5 мл,

ветс Есл

то при низкой концентрации фракции, ее мож но не уловить. Если брать больший объем л о соответственно следует увеличить ди- амегр фильтра, объем окислителя, а следовательно.и время реакции. Учитывая, а 6-7-ой минутах в реакцию вступают е пигменты - билирубин,- биливердин, дополнительно новые цветные кольца, ение фореграммы с целью выделения

иных уробилинов (I и D) будет затруднено. Сохранение же Диаметра фильтра и объема окислителя при увеличении объёма сыворотки крови приведен только к увеличению объема невпитавшейся сыворотки.

Так

сак авторы стремились сократить объем

исс/ едуемой жидкости, то выбрали его равным

0,5±0,05 мл.

центр пропитанной таким образом бумаги наносится капля азотной кислоты желтого цвета от присутствия в ней азотистой и по появлению в ней концентрических колец последовательно: бирюзового, всех оттенков фиолетового, желтого (в центре) зсех вместе или какой-то одной окраски судят р присутствии всех вместе или какой-то одной фракции.

Пример конкретного исполнения.

1. Больной Калягин Т.П., 50 лет, ист. б-ни № 1DOO. Диагноз: хронический персистиру- ющий гепатит, У больного из сыворотки крови, взятой в биохимическую лабораторию для планового лабораторного обследования, взяли 0,5 мл сыворотки крови, пипеткой нанесли ее на фильтр, находящийся на гор.й- 5 зонтал ьном уровне, смочен ный Дистиллиро- ванной водой. Фильтр пропитывался 10 мин. Невпитавшуюся сыворотку крови стряхивают о край, фильтр в строго горизонтальном положении (по уровню) помещают на

0 стекло, в центр наносят 0,01 мл окислителя. По истечению 1 мин в центре появился ровный желтый круг с белвы ареолом (коагулировавший белок); 5 мин - картина та же, но ярче, 10 мин - картина тажё. Т.е. в данной

5 пробе сыворотки крови фракции 1-й D-от- сутствуют, а есть только стеркобилин (физиологическая норма). Спектральный анализ этой же пробы дал результат: стеркобилин 100%: I уробилин 0%; D-уробилин 0%.

0 2. Больная Киселева Т.П., 58 лет, ист. б-ни № 1162. Диагноз: вирусный гепатит. Из сыворотки крови больной, взятой для планового лабораторного обследования взяли 0,5 мл сыворотки, пипеткой нанесли на фильтр.

5 смоченный дистиллированной водой, находящийся в чашке Петри на горизонтальном уровне. Фильтр пропитывается 10 мин. невпитавшуюся сыворотку крови стряхивают о край чашки, фильтр в строго горизонталь0 ном положении (по уровню) помещают на стекло, в центр его наносят 0,01 мл окислителя, и в первые же секунды появляется : розовое пятно (мезобилиродин), второе кольцо фиолетовое (мезобиливиолмн), через

5 1 мин в центре желтое пятно, внешне кольцо фиолетовое; 3 мин - та же картина, но ярче, на 5-ой минуте картина сглаживается, но появляется кольцо билирубина (общего). У данной больной вирусный гепатит, для котр0 рого характерно повышенное содержание 1-уробилина, который в процессе окисления дал кольцо мезобилиродина и меЗобиливи- олина, и повышенное содержание стёркоби- лина (желтое пятно). Данные спектрального

5 анализа: стеркобилин 45%; 1-уробилин 55%; D-уробилин 0%.

3. Больной Бусыгин И.Ф., 66 лет, ист. б-ни №. 1245. Диагноз: первичная ВЬпечени, В процессе планового лабораторного об0 следования взято из вены 2 мл крови, путем центрифугирования.получена сыворотка крови и 0,5 мл ее нанесены на фильтр, смоченный дистиллированной водой, расположенный в чашке Петри на строго

5 горизонтальной поверхности, через 10 мин невпитавшаяся сыворотка стряхивается о край чашки, фильтр помещается на стекло, расположенное.на горизонтальной поверхности и в центр фильтра вводится 0,01 мл окислителя, В первые секунды появляется

бирюзовая окраска, к 30 с она становится лазурно-бирюзовой (глаукобилин), 1 мин - окраска еще ярче, а круг больше, на 2-ой минуте появляется фиолетовое кольцо (ме- зобиливиолин), а в центре желтое пятно. К 5-ой минуте преобладает круг лазури с бирюзовой, узкое кольцо фиолетового цвета и в центре небольшое желтое пятно. У больного преобладает фракция D-уробилина (продукт его окисления - глаукобилин). Значительно меньше фракции 1-уробилин (присутствие мезобиливиолина), желтое пятно - стеркобилин, Результат спектрального анализа: стеркобилин 25%; 1-уробилин 27%; D- уробилин 48%.

Таким образом, в трех сыворотках кро- ви предложенным способом разделены фракции уробилина, в первом только стеркобилин, во втором - 1-у робилин и стеркобилин и в третьем все три фракции - I. D-уробилин и; стеркобилин.

С.помощью описанного способа проведения мезобиливиолиновой реакции на бумажном фильтре обследована сыворотка крови.

В группы обследуемых вошли:

доноры 20, ,

больные 125.

Получены следующие результаты: у 20 доноров из 20 на фильтре развивалось только желтое пятно, в тех же образцах сыворотки крови методом спектральной оценки

мезобиливиолиновой реакции в 20 случаях зафиксировано 100% содержание стерко- билинэ. У больных в 55 случаях развивались красно-фиолетовое кольцо v желтое пятно, что свидетельствует о присутствии 1-уробилина и стеркрбилина. В тех же случаях спек- тральный анализ показал присутствие 1-фракции и стеркобилина, их процентное соотношение колебалось в разных пределах. У 50 больных на фильтре зафиксировано от центра к периферии желтое пятно, изумрудно-голубое, красное, фиолетовое, что говорит о присутствии фракций I-, D- и стеркобилина. Их соотношение, как правило, поданным спектрального анализа составило по 30-35 процентов. У 20 больных в первые же секунды на фильтре развивалась изумрудно-голубая окраска, затем она растекалась кольцом вокруг желтого пятна, что говорило о присутствии фракции D-уробилина и стеркобилина. Спектральный анализ показал их разное процентное соотношение.

Использование: медицина, а именно при исследовании биологических жидкостей может быть использовано в лабораторной диагностике. Цель изобретения - упрощение и ускорение способа разделения фракций уробилина в сыворотке крови. Сущность изобретения: на фильтр из бумаги для электрофореза диаметром 25-30 мм, пропитанный в течёте 10-15 мин 0,5 мл сыворотки крови, наносят 0,01 мл азотной кислоты жёлтого цвета от присутствия азотистой и по появлению в месте нанесения азотной кислоты бирюзовой окраски в первую минуту - судят о присутствии D-фрак- ции, по появлению только пурпурной и фиолетовой окраски - 1-фракции, по появлению желтой - L-уробилина (стеркобилина), по появлению окрасок: бирюзовой, за ней кольца пурпурно-фиолетовой, с последующим развитием желтой (в центре) судят о присутствии всех трех фракций.

Формула изобретения

Способ определения фракций уробилина в сыворотке крови, включающий проведение мезобиливиолиновой реакции,от л и- чающийся тем, что, с целью упрощения и ускорения способа, берут бумажный фильтр диаметром 25-30 мм, который пропитывают в течение 10-15 мин сывороткой крови в объеме 0,5 мл с последующим нанеСравнительная таблица прототипа и предлагаемого метода разделения фракций

1,-1-, D-уробилина

сением в центр фильтра 0,01 мл концентрированной азотной кислоты с примесью азотистой кислоты и при появлении в течение первой минуты бирюзовой окраски судят о присутствии D-уробилина, желтой - L-ypo- билина, пурпурной и фиолетовой - -уробилина, а при последовательном появлении бирюзовой, пурпурной, фиолетовой и желтой окрасок судят о присутствии всех трех фракций уробилина.

П рр дол жен йе; табл и цы