Способ иммунологического определения одновалентных аналитов Советский патент 1993 года по МПК G01N33/577 

Изобретение относится к способу обнаружения аналитов с помощью иммунологи- ческого метода.

Целью изобретения является повышение специфичности определения путем под- готовки рецептора с повышенной специфичностью.

Неожиданно путем применения смеси моноклональных антител, из которых каждое не удовлетворяет требованиям специфичности и сродства, удалось получить тест-систему, специфичность которой улучшена по сравнению с индивидуальными веществами.

Для иммунологического способа, известного (конкурентоспособного) обнаружения имеется множество вариантов, которые общеизвестны. Как правило, для моновалентных аналитов, в особенности гаптенов, предпочтительны два тест-принципа: либо рецептор, который связан с твердой фазой, ,-г реагирует с пробой и маркированным аналитом, либо маркированный рецептор реагирует с пробой и связанным с твердой фазой аналитом. В случае относящегося к изобретению, как правило, антитело используется в эквимолярном количестве или в избытке.

Образовавшиеся комплексы можно разделять и известным образом оценивать маркировку.

В зависимости от соответствующего способа, предлагаемая согласно изобретению смесь антител может использоваться в качестве маркированного рецептора, связанного с твердой фазой рецептора, агглютинирующего рецептора и т.д. Для используемой согласно изобретению смеси антител выбираются моноклональные антитела, сродство которых находится в оптимальной области и которые обладают немногими перекрестными реакциями, причем перекрестная реакционноспособность лежит выше заданного значения. Перекрестные реакционные способности используемых для смеси антител различны, т.е.

v| О О

±

СЈ

антитела реагируют с различными, подобными обнаруживаемому веществу соединениями. Т.е. антитело вступает в перекрестные реакции с веществами, с ко- торыми другие антитела доказуемо не реагируют или практически не реагируют (и наоборот). Перекрестная реакционноспЬ- собнрсть антитела к определенному вёще- : ству при этому не я вл я етея никакой абсолютной, а является относительной ве- ; личиной измерения, которая зависит от со- ртветствующей тест-системы. Репером (точкой отсчета) является определяемый аналит, с которым специфически связано антитело. Измерительный сигнал, который достигается при реакции с анёлитрм, уста-, навлйвается вплоть до 100%. 8 отсутствии или в присутствии аналита задаются различные концентрации перекрестно реагирующих веществ для тест-раствора. С ; перекрестно реагирующим веществом/за-; тем получается измерительный сигнал , кр- торый соответствует определенному .количеству собственно аналита. Отсчёт идет в области самой высокой прецёзионностй

калибровочной кривой. Этот :сигна л также- выражается в процентах. Перекрестная ре- ; акция, например, 10% обозначает, что нужно использовать 10-кратное количество ; перекрестно реагирующего вещества, что- бы достичь такого же измерительного сигйа ла; как и с помощью однократного

, количества аналита. В другой тест-системе.

/для перекрестно реагирующего вещества

можно определить другое значение. Требу;- еМые в тесте перекрестные реакции (задан- v.: ные ./ . значения) -. зависят: от

концентрационного соотношения сЬответ; ствующегб перекрестно реагирующего вё- : щества д аналиту и поэтому быть

;: очень | 3fli«f«t bf; ::Vt; :-: // - ; :;;- :5. :: ;.:-:

: ;. : Для изобретения можно применять .монрклональйые антитела, перёкрестная рёакцйс)йноспособность :f - которых

относительно вещества составляет до трех:: кратного;, предпочтительно вплоть до Двух: кратного верхнего заданного ;значеНйя,

Заданная область йеж йт; между (пределом)

границей обнаружения и принимаемой во

внимайиё для соответствующего теста гра; ницей погрешности; Согласно изобретёт

нию,йсг1ользуют смесь по меньшей Мере

двух:монокяЬнальНых антител. Также можно смешивать более, чём 2 видов Мрйокло- нальных антител. Соотношение, в kofopoM находятся ийдивидуальныё мрноклональ- ; ные антитела в смеси, выбираётс я в заййси- мости от их сродства и специфичности. Как правило, антитело с минимальной перекре- стнЬй реакционной способностью имеется

0

5

0

5

0

5

0

5

5

в большом количестве. Соотношение отдельных антител выбирается в зависимости 6т данных условий. Предпочтительно используют смесь двух антител, соотношение между которыми составляет 0,1-10:1.

Путем смешения по меньшей мере двух антител, которые вступают с различными соединениями в. мешающие побочные реакции, в целом снижается перекрестная реак- циОНноспрсобность. Это снижение, как правилЬ, при этом превышает эффект разбавления, так что очевидно имеется сине- ргетическое повышение действия.

Предлагаемый в изобретении способ позволяет использовать моноклональные антитела, которые не идеальны ,в отношении специфичности. Скрининг таких, толь.ко частично пригодных для теста антител, ме неё рискован и поэтому дешевле и быстрее. Ёлагодаря применению смеси двух или бо- ;,fl.ee. моноклональных антител, из которых каждое непригодно для терта само по себе по отдельности, можно иметь достаточно спёцифичеекйе тёст-системы, так как благодаря смешению нескольких антител с раз-. личной /У:.: :.; / ;перекрестной реакЦионйоспособноСтью в целом может иметься в распоряжении система, которая удовлетворяет требованиям; : .

Изобретение поясняется следующими примерами. Ч;:-,Х. v ....:.

При м е р .1. Определение концентрации стероида в растворах.: .- : Для обнаружения стероидов в буфере или жидкостях организма (сыворотка, плазма, моча и т.д.), используют ферментный тест по следующему конкурентному прин ЦИПу::. ; ; ; -;v- V/- V.; ;-. ... .-... - . Материалы: трубка (пробирка) Z игап без

покрытия; стрептавидин; альбумин сыворотки крупного рогатого .скота (RSA); рас- :тврр : субстрата:. (100 ; ммоль/л . фосфат-цитратнЬго буфера, рН 4,4, 3,2 ; ммоль/л: пербората натрия, 1,9 ммоль/л ABTS/ диаММониевая соль, 2,2 -азино-дй- ; /З-этйл-бёнзтиазолйнсульфркислоты (6)/; буфер Для покрытия.: 200. ммоль/л натрий- карбонат/ного буфера, рН 9,6; буфер для раз- бавлёйия: 50 ммоль/л натрййфосфатного буфера, рй 6,8; 0,3% RSA; промывной рас- ; тр6р:0;9% ШС. f : ::- - : :.; v-v.. -У

; Бйотинйлйрование MAKS осуществля ется согласно 1ACS100/(1978) 3585-3590 с биотипом путём взаимодействия с. N-окси- сукцйнимйдбиртйном в соотношении 10:1.

; (Трубки) пробирки с препаратом очищенного раствора антитела (10 мкг/мл) в покрывном буфере(0,2 моль/л карбонат) бикарбонат натрия, рН 9,6 инкубируют при комнатной температуре в течение 1 ч. Происходит спонтанное связывание этого антитела со стенкой пробирки. Пробирки затем дополнительно обрабатывают с.помощью 50 ммоль/л фосфатного буфера 0,3% альбумина в течение J.5 мин и промывают.5

Специфические: антитела добавляют в буфер для разбавления и инкубируют в течение 60 мин. Затем добавляют 600 мкл пробы (аналит, перекрестно реагирующие вещества и т.д.) и 500 мкл крнъюгата 10 фермента (Эстриол-РОД, РОД - активность: 200 mU/мл) и инкубируют 60 мин. Для того, чтобы дополнительно исследовать перекрестную реакцию к другим стероидам, добавляют к раствору пробы различные ко- 15 личества испытуемого стероида. Понижение измерительного сигнала за счет других

стероидов обозначает перекрестную реакцию, высота которой на стандартной кривой может.отсчитываться с помощью подлинно- 20 го аналита. После дальнейшей стадии про- мыв ки определяется активность пероксидазы .путем добавки раствора субстрата, для проявления красителя (1000 мкл) предварительно осуществляют дальней- 25 шую инкубацию (30 мин). Измерение окрашенной смеси осуществляется при 422 нм на фотометре. . .

Пробирки с раствором стрептавидина инкубируют в течение 1 ч (при комнатной 30 температуре в покрывном буфере и дополнительно обрабатывают с помощью 50

ммоль/л фосфатного буфера, 0,3% альбумина в. течение 15 мин и промывают. ; Специфические антитела добавляют в 35 буфер для разбавления и инкубируют в теение 60 мин. Затем добавляют 600 мкл пробы (аналит, перекрестно реагирующее вещество и т.д.) и 500 мкл коньюгата фермента (Эстриол-РОД, РОД - активность: 200 40 мУ/мл и инкубируют в течение 60 минут. --..Для того, чтобы дополнительно исследовать перекрестную реакцйю к другим стероидам , к раствору пробы добавляют различные ко- .. ичества испытуемого стероида, Снижение 45

измерительного сигнала за счет других стероидов означает перекрёстную реакцию,

ысота которой может; отсчитываться на стандартной кривой с подлинным знали- : том. После дальнейшей стадии промывки 50

определяется активность пероксидазы путем добавки раствора субстрата, для проявения красителя (1000 мкл) осуществляют предварительно:дальнейшую инкубацию 60 минут). Измерение окрашенной смеси 55 существляют при 422 нм в фотометре, П. р и м.е р 2. Определение перекрестHbix реакций для смесей МЛК (Экстриол 19.6,9 и МАК Экстриол.1.26.18 Материалы:

-/ЕЗ РОД-конъюгат/ЕЗ-РОД-Конъюгат готовят так, что экстриол активируют в 6-по- ложении с помощью неполного сукцината и затем этерифицируют сукцинимидом, Полученный сложный эфир сочетают непосредственно с пероксидазой (500 и 100 mU РОД - активность/мл - МАК ЕЗ) 19.6.9 (ЕСАСС89082503) биотинилируют (100 мкг/мл)

- МАК Е3 1.26.18 (ЕСАСС 89082502) биотинилируют (1000 мкг/мл). Концентра-. ции используемых, перекрестно реагирующих веществ: Эстриол (ЕЗ): 0, 5, 10, 20, 40 нг/мл) в тесте 1:5 разбавление/Экстрадиол (Е2): 10, 100 нг/мл. Эстетрол (Е4): 10, 100 нг/мл. ЕЗ-3-сульфат: 50, 100 нг/мл ЕЗ-3- тлюкуронид: 50, 100 нг/мл

Осуществление определения происходит согласно примеру 16.

. Результаты показывают, что МАК 19.6.9 сильно перекрестно реагирует с эстрадио- лом и эстетролом, в то время как МАК Т.26.18 сильно перекрестно реагирует с эс- триол-3-сульфатом и эстриол-3-глюкурони- дом. Антитела используют в различных соотношениях в смеси. При различных соотношениях компонентов в смеси изменяются соответствующие перекрестные реакций. Получается более .оптимальная и более предпочтительная область.

При мерЗ. Определение перекрестных реакций для смесей МАК эстриол 19,6,9 и МАКэстриол 9В4.С2,.

Осуществление определения происходит аналогично примеру 1а. МАК 9В4.С2 (Изготовитель IPL, Interpharm Laboratories Ltd, Negg Ziona 76110, Израиль) реагирует аналогично 1.26.18 сильно перекрестно с ЕЗ-3-сульфатом и ЕЗ-3-глюкуронидом. :

Также здесь получается МАК-концент- рация, при которой XR отчетливо снижена.

Пример 4. Определение перекрестных реакций для смесей МАК тестостерон) 8.15.1 и МАК тестостерон 700-03

Материалы:

- непокрытые пробирки Zurem

-поликлрнальные овечьи антитела (igG) против мышиного Fc)(i0 мкг/мл; для покрытия пробирки) , Кротеин С . .

Тестостерон РОД - коньюгат (тестосте- рон-РОД - коньюгат готовят так, что тестостерон :актив;ируют в 3-положен.ии с помощью карбоксиметилоксинэ и;этерифи- цируют сукцинимидом. Полученный сложный эфир сочетают прямо с РОД/РОД - активность 100 mU (мл),

Тестостерон

4-андростен-3.17-дион андростендион

11-кето-тестостерон

МАК/тестостерон 8.15.1 (ЕСАСС 89082501)

Мак/тестостерон/700-03 (изготовитель. Medi x Btatech Inc.,

Forster City, CA 94404, США: Bert - № T-700-03).

Концентрация используемых перекрестно реагирующих веществ:

тестостерон: 0. 1,25, 2.5. 5. 10, 20. 40 нг/мл

андростендион:2,5,5.10,20,40,80.160 320, 640 нг/мл

11-кето-тестостерон: 2,5, 5. 10, 20, 40, 80. 160, 320. 640 нг/мл определение осуществляют аналогично примеру 1а. Результат:

МАК 8.15.1 и МАК700-03 являются специфическими антителами против тестостерона. однако, показывают относительно высокий XR к андростендиону. соответственно. 11- кето-тестостерону.

Неприсоединенные антитела используются в различных соотношениях в смеси.

П р им е р. 5. Определение перекрестной реакции дя смесей МАК фенобарбитал 2.341.115 и МАК фенобарбитал 2.93.37 Материалы:

трубы дурана без покрытия.

поликлональное антитело овцы (IgG) против мыши - Fey (г/мл)

для нанесения покрытия на трубы),

кротеин С.

коньюгат фенобэрбиталэ-РОД (конъю- гат фенобарбитала-РОД получают в результате того, что производят активйрование через N в 1-положении бутиратом и этери- фикацию посредством сукцинимида. Образованный сложный эфир связывают непосредственно с РОД (активность РОД 100 милли-единиц/мл).

фенобарбитал,

секобарбитал,

амобарбитал,

пентобарбитал,

примидон,

МАК/фенобарбитал 2.341.115 (ЕСАСС 90071903).

МАК/фенобарбитал/2.93.37 (ЕСАСС 90071904).

Концентрация введенных перекрестно реагирующих веществ:

фенобарбитал: 0. 7.8. 15.6, 31.3, 62.5, 125 нг/мл

секобарбитал: 0.2, 1 //г/мл, амобарбитал: 0,2. 1 fir/мл пентобарбитал: 0,2, 1 // г/мл примидон: 1.5// н/мл.

Определение производят аналогично примеру 1а. Результат:

МАК 2.341, 115 и МАК2.93.37представ- ляют специфические антитела относительно фенобарбитала, но показывают сравнительно высокие перекрестные реакции, во-первых, к примидону (МАК 2.341.115), во-вторых, к секобарбиталу. амобарбиталу и пентобэрбиталу (МАК 2.93.37).

Антитела применяют в различных соотношениях между частями смеси.

На перекрестную реакцию МАК-смеси относительно фенобартитала может оказы- вать влияние смешивание. И здесь может применяться соотношение между частями смеси, при котором все перекрестные реакции лежат ниже ожидаемых величин. Формула изобретения 1. Способ иммунологического определения одновалентных аналитов путем конкурентного связывания определяемого аналита с определенным количеством мар1- кированного или иммобилизованного моно- клонального антитела, отличающийся тем, что, с целью повышения специфичности, используют смесь не менее двух моно- клональных антител, специфически способных связываться с аналитом, пере- крестная реакционноспособность которых различна.

2. Способ по п, 1, о т ли ч а ю щ и и с я тем, что используют смесь двух монокло- нальных антител в соотношении 0,1 - 10:1.

3. Способ по пп, 1 или 2, отличающийся тем, что используют трехкратно количество моноклональных антител по отношению к аналиту с перекрестной реэкци- оннослособностью к одному или нескольким веществам.

Использование: для обнаружения одновалентных аналитов иммунологическим методом. Цель: повышение специфичности определения. Сущность изобретения: для обнаружения аналитов с помощью иммуно- логического способа используют смесь не менее двух способных специфически связываться с аналитом моноклинальных антител, перекрестная реакционноспособность которых различна при соотношении антител 0,1-10:1 и трехкратном количестве МКА по отношению к аналиту. Положительный эффект: применение смеси моноклональных антител из которых каждое не удовлетворяет требованиям специфичности и средства, обеспечивается получение тест системы, специфичность которой улучшена по сравнению с индивидуальными веществами. 2 з.п. ф-лы. (Л С