Способ определения поливалентного антигена Советский патент 1989 года по МПК G01N33/53 

1

Изобретение относится к иммунохи- мическому способу определения поливалентного, т0ес по меньшей мере бифункционального, лиганда (антигена) в жидкой пробе0

Цель изобретения - повышение точности и упрощение способа.

Пример 1. Определение тирео- тропина (TSH).

Рецептор 1 антитела первого порядка и рецептор 3 (меченые Fab-фрагмен- ты антител первого порядка) происходят из одного и того же вида животных (мыши); рецептор представляет

собой маркированный Fab-фрагменте Рецептор 1 представляет собой моно- клональное антитело, Fab-фрагмент в рецепторе 3 также происходит из моноклонального антитела, которое (направлено против другого детерминанта TSH, , чем моноклональное антитело рецептора 1. Рецептор 2 происходит из овцы и направлен против Fc-части моноклонального антитела

МЫШИ о

4

СЛ 4ь

СО

1C

см

Реактивы для осуществления способа

3147

Инкубационный буфер (IP): 15ммолъ натрийфосфатного буфера, рН 7,14, 154 ммоль NaCl, 5 ммоль EDTA, 0,2% TSA, рН 7,4.

Рецептор 1 (антитела первого порядка) ; анти-TSH - антисыворотка мыши (рецептор 1)„ Содержащая моно- клональные анти-Т8Н-антитела асцитная жидкость из мышей смешивается с коли- чеством до 1,8 М с ( Осадок растворяется в буфере из 15 ммоль фосфата натрия, рН 7,0, и 50 ммоль №аС1 и таким образом полученный раствор подвергается пропусканию через DEАЕ-целл кшо з у.

Рецептор 3 (меченые антитела): Анти-ТЗН-антитело (моноклональное), которое распознает другой антигенньрй детерминат, чем рецептор 1. Конъюгат пероксидазы (рецептор 3): мышиная анти-ТЗН-антясьшоротка очищается как рецептор 1„ Последующее получение (Fab)2 из комплектной молекулы

антитела осуществляется аналогично. Связывание с пероксидазой хрена0

Рецептор 2 (антитела второго порядка) : адсорбирующий материал с фиксированным овца-анти-мышь FcJ - антителом (рецептор 2-адсорбер). Овечья антимьшиная Fc jf -антисьшоротка смешивается с количеством до 1,8 М с Осадок растворяют в буфере 1 ил 15 ммоль фосфата натрия, рН 7,0 и 50 ммоль NaCl и таким образом полученный раствор пропускают через DEAE-целлюлозу. Содержащую IgC-фрак- цию (рецептор 2) связывают с адсорбентом, средства, активированным глу- таровым альдегидом Bochringer Mann- helm

Индикаторный реактив: 1,8 ммоль ABTS ,2 -азино-ди(3-этилбензтиазо- линсульфонат-бУ, 3,3 ммоль пербора- та натрия в 100 ммоль фосфатно-ци- тратного буфера, рН 4,4

Способ осуществляют следующим образом

А. 50 нгс рецептора 1 и 170 пг/мл рецептора 3, растворенные в инкуба- ционном буфере, накапывают вместе на прочес (слой волокнистой массы), состоящий из полиэфирной бумаги размером 6x6 мм, толщиной 1,0 мм, и

высушивают при комнатной температу ре о Содержащее этот реактив бумажное полотно называется реактивным носителем 1 „

L На реактивный носитель 1 наносят пипеткой 40 мкл определяемой пробы, содержащей известное количество антигена стандартного раствора, затем прочес (слой волокнистой массы) тотчас отделяют центрифугированием в центрифуге Eppendorf, причем реактивный носитель 1 размещается на Eppendorf колпачке, а элюированная жидкость в колпачке (Hiitchen) во время центрифугирования попадает на рецептор 2, который связан с адсорбером, и реагирует с ним. Из рецептора 2 используется 2,5 мг адсорбированного материала на тест.

На аппаратуре со встряхиванием инкубируется реакционная смесь в течение 15 мин при 37°С.

Спустя 15 мин реакционные сосуды вынимают из аппаратуры и центрифугируют.

Отбирают аликвотную часть надоса- дочной жидкости с помощью пипетки и определяют образовавшийся краситель по его экстинкции при 405 нм.

С помощью двух различных TSH-проб определяются следующие значения экстинкции, приведенные в табл01 Таблица 1

TSH, pMn |

J405

НМ/СМ

зо ,„

.,.

50 55

Значения экстинкции определялись при толщине слоя 0,2 см и пересчитывались на толщину слоя 1 см„

Б0 Простой Сэндвич (сравнение).

Осуществляют по А, но 2,5 мг адсорбера - рецептора 2 предварительно инкубируется в течение 1 ч с 20 мкг рецептора 1 в 0,2 мл при встряхивании Затем надосадочная жидкость отсасывается и остаток промывается трижды по 1 мл IP.

Таким образом предварительно обработанный рецептором 1 адсорбер-рецептор 2 инкубируется 4 ч с пробой и рецептором 3 в аппаратуре со встряхиванием при 37 С, причем в этом варианте отпадает добавка растворимого рецептора 1„

Затем надосадочная жидкость отсасывается, остаток промывается и фиксированная активность фермента определяется с помощью индикаторного реактива

С помощью двух различных TSH-проб определяются следующие величины экс- тинкции, приведенные в табл„2.

Таблица 2

Чувствительность значительно меньше, чем согласно п.А, хотя в п.Б используется значительно больше рецептора 1, чем в По А (соотношение 1:400).

Пример 2. Определение чело- ве 1еского хориогонадотропина (HCG) .

Реактивы.

Буфер А: 100 ммоль фосфата натрия рН 7,3 (37°С), 2 ммоль хлорида магния, 0,9% NaCl, 0,5% RSA (альбумин сыворотки крови крупного рогатого скота).

120 мкг/мп анти-HCG моноклональ- ного антитела из мыши в виде асцита (рецептор 1)„

.100 пг/мл (мл анти-НСС-антитело - (овца) - РаЪтфрагмент-р -галактозида за - конъюгат) рецептора 3.

Приготовление Fab-фрагмента осуществляется согласно T.Kitagawa

Ковалетное связывание |5 -галакто- зидазы с антителом, соответственно с АК-фрагментом, осуществляется по методу R.PoPoster.

Субстратный раствор: как и буфер дополнительно содержит 5 ммоль (ONPG) орто-нитрофенилгалактозида.

Приготовление реактивного носителя 1 осуществляется аналогично приме меру 1. 40 мкл раствора А накапывают на слой волокнистой массы (прочес), состоящий из полиэфирной бумаги, и затем высушивают при комнатной температуре. Хранение слоя волокнистой массы (прочеса) вплоть до его использования осуществляется при 4° С и относительной влажности воздуха Ј20%.

Приготовление реактивного носителя 2 на целлюлозном прочесе (слое волокнистой массы) по способу активирования бромцианом фиксируется :М - Fc У -антитело овцы (lgG-фракция), причем на 1 г волокнистого материала для фиксации берется 10 мг антитела. Путем промывки удаляется несвязанное антитело, и прочес (слой волокнистого материала) осторожно высушивают

15

25

30

20

при комнатной температуре. Хранение волокнистого материала (прочес) осуществляется аналогично реактивному носителю -1 о

Определение НСС осуществляют с помощью реактивных носителей 1 и 2 описанным в немецкой патентной заявке № 24250085 устройством,, УстройЮ ство для осуществления аналитических определений включает роторный вставной элемент .для центробежных (центрифужных) аналитических автоматов, состоящий из формованного корпуса, который имеет камеру для ввода пробы, связанную с множеством реактив областей, содержащих пропитанный определенным реактивом всасывающий носитель, по крайней мере одну- камеру со смесительным клапаном и измерительную камеру, которые вместе образуют транспортировочный путь испытуемой жидкости (жидкости пробы), который идет радиально изнутри до, далее радиально наружу, когда вставной элемент укреплен на роторе, и далее, по крайней мере одну-две камеры для приема жидкости, и транспортировочный путь, который ведет из этой камеры к осуществлению измерения и идентичен по меньшей мере частично транспортировочному пути испытуемой жидкости. При этом транспортировочный путь испытуемой жидкости идет от камеры для ввода пробы (Р) через заполненную поглощающим материалом содержащую буфер камеру q. , камеру с и расположенную между камерами Q и с первую клапанную коробку

0 VKY, к второй клапанной коробке VK2 и из нее через камеру J и через приемную камеру АК в измерительную камеру К. Для принятия дальнейшей жидкости предусмотрена камера, вы5 полненная в виде насосной камеры, для субстрата РК, которая через состоящее из дозировочной камеры ДК и капилляра Кар дозировочное устройство и переливную камеру UK связана с второй клапанной коробкой VK2,

При этом реактивный носитель 1 помещается в поле с вставного эле35

0

мента, а реактивный носитель 2 - в поле d о Осуществление реакции со- ответствует примеру 1„ При этом пипеткой вносят 40 мкл пробы через отверстие в верхней части края непосредственно в поле 6 . Проба неразбавленная. Высокая скорость вращения

чередуется с состоянием покоя, затем проба и субстрат движутся ъ направлении разделительной матрицы и кюветы.

Перенос пробы из поля с в с) осуществляется в течение очень короткого времени ( 60 с)„ Ведущий в конечном счете к индикации объем субстрата составляет также 40 мкл, так что никакого разбавления пробы до измерения сигнала не происходит.

При применении калибровочной сыворотки получается калибровочная кривая, которая охватывает область 0- 100 пг/мл HCG (мл) стандартизование по 1-му IRP-стандарту для HCG, и становится возможным достаточно чувствительное измерение HCG в сыворотке и плазме.

Пример Зо Определение альфа- 1-фетопротеина (AFP)0

Применяют маркированный гаптеном рецептор 1, причем все три антитела происходят из одного и того же виДа животных.

Осуществление и используемый буфер соответствует примеру 2.

В качестве рецептора 1 используются анти-АРР-антитело овцы (100 нг/мл), которые маркированы дигоксином (согласно патенту ФРГ № 2537129), в ка- честве рецептора 3 используются анти-AFP - антитела овцы, маркированные р -галактозидазой согласно примеру 2, и в качестве твердофазно связанного рецептора 2 применяются бумажные диски из полиэфирной бумаги, с которыми адсорбционно связы- i вают антитела против дигоксина овцы„ Способ нанесения покрытия соответствует известному для пластиковых трубочек способу0

Пример 4о Определение тире- отропина (TSH)0 Реактивы.

Инкубационный буфер (IP): 15 ммоль натрийфосфатного буфера, рН 7,4, 154 ммоль NaCl, 5 ммоль ЕДТА, 0,2% PSA, рН 7,4о

Рецептор 1: овечья анти-TSH - ан- тисыворотка0 Неочищенная.сыворотка смешивается с количеством до 1,8 М с NH4S04о Осадок растворяется в буфере из 15 ммоль фосфата натрия, рН 7,0, и 50 ммоль NaCl и таким образом полученный раствор подвергается пропусканию через ДЕАЕ-целлюлозу. Содержащая IgG-фракция затем освобождается от реагирующих с альфа-цепью TSH0

5

0

5

0

5

0

5

0

5

частей путем пропускания через нагруженный HCG иммуноадсорбер. Элюат подается на нагруженный TSH иммуноад- сорбер. После промывки адсорбера происходит элюирование иммунореактивных против TSH антител с помощью 1 М про- пионовой кислоты,, Элюат затем диализу- ется по отношению к IP, при известных условиях концентрируются путем ультрафильтрации0

Рецептор 3: конъюгат антитела - пероксидаза0 Дальнейшая овечья анти- TSH - антисьюоротка очищается как рецептор 1 и затем из нее получают (Fab)2-фрагменты„ Приготовление (Fab)2-фрагментов осуществляется согласно EoZamoye0

Рецептор 2. Материал адсорбера с фиксированным ослиным-антиовечьим FcJ - антителом,, Ослиная-антиовечья Fcjf -антисыворотка смешивается в ко- личестве до 1,8 М с Осадок растворяют в буфере из 15 ммоль фосфата натрия, рН 7,0, и 50 ммоль NaCl и таким образом полученный раствор пропускают через ДЕАЕ-цедлюлозу0 Содержащую IgG-фракцию (рецептор 2) соединяют с адсорбентом средства, активированным глутаровым альдегидом Boeqringer Мдцпйехга (определение jp 665525) по рабочей инструкции изготовителя.

Индикаторный реактив: 1,8 ммоль ABTS Ј2,2 азино ди(3-этилбензтиазо- линсульфонат-бУ, 3,3 ммоль пербора- та натрия в 100 ммоль фосфат-цитрат- ного буфера, рН 4,4.

Способ осуществляют аналогично примеру 1, причем в этом случае ЮОнг рецептора 1 и 100 пг/мл рецептора 3, растворенные в инкубационном буфере (40 мкл), накапывают на целлюлозный прочес (слой волокнистой массы) размером 6x6 мм. После высушивания хранение прочеса вплоть до применения его снова осуществляют при 4°С„

Дальнейшее осуществление соответствует примеру 1 о В качестве пробы используется 40 мкл.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет точнее определять антигены, содержащиеся в малых количествах (40 пг/мл). Кроме того, достигается упрощение способа, так как не требуется получать первый и третий рецепторы из двух различных видов животных

9147549210

Формула изобретенияконкурентным методом по активности

Способ определения поливалентногометки, отличающийся тем,

антигена, включающий добавление егочто, с целью повышения точности и

к специфическим моноклональным анти-упрощения способа, перед добавлением

телам или фрагментам антител первогоантигена специфические антитела пер-

порядка, антителам второго порядка,вого порядка и меченые Fab-фрагменты

связанных с твердой фазой и специфич-этих антител наносят на твердую фазу,

ных к FC-фрагментам антител первоговысушивают, далее после добавления

порядка, к Fab-фрагментам антителюантигена смесь центрифугируют и надпервого порядка, маркированных меткой,осадочную жидкость соединяют с анти-

с последующим определением антигенателами второго порядка.

Изобретение относится к иммунохимическому способу определения антигена в жидкой пробе. Целью изобретения является повышение точности и упрощение способа. 50 нг антител первого порядка и 170 MU МЕЧЕНОГО (FAB)₂-фрагмента этого антитела помещают на слой волокнистой массы, состоящей из полиэфирной бумаги размером 6х6 мм, толщиной 1,0 мм, и высушивают при комнатной температуре. Далее на этот носитель помещают определяемый антиген, центрифугируют и надосадочную жидкость соединяют с антителами второго порядка, связанными с твердой фазой и специфичными к FC-фрагменту антител первого порядка. После инкубирования реакционной смеси ведут определение антигена по индикаторному реактиву в иммуноферментном анализе. Точность способа возрастает за счет повышения чувствительности иммуноферментного анализа до 40 рд/мл. Упрощение достигается тем, что первое антитело и меченое антитело могут быть получены от одного животного.