Способ определения @ -амилазы поджелудочной железы Советский патент 1991 года по МПК G01N33/577 

Изобретение касается способа определения о(-амилазы поджелудочной железы наряду с о(-амилазой слюны для диагностических целей.

Целью изобретения является повышение точности определения 0 -амилазы поджелудочной железы.

Способ осуществляют следующим образом.

Ингибируемая эффективность моно- клонального антитела, которое не полностью удовлетворительно подавляет фермент слюны, синергически усиливается с помощью лишь связующего, но практически не подавляющего или не полностью подавляющего моноклонально- го антитела, и количественное подавление фермента слюны может быть доетигнуто при получении 100%-ной активности фермента поджелудочной железы. Таким образом удается существенно сократить время инкубации.

Для предлагаемого способа в качестве первого моноклонального антитела используют предпочтительно полу- . ченные из зарегистрированных в .NCACC под номерами (99D12) 84122003 и (89Е2) 84122004 (Национальная коллекция животных клеточных культур, Нортон Даун, Великобритания) клеточных культур антитела. В качестве второго моноклонального антитела предпочтительно используются опубликованные в европейской заявке № 84114172.4 связующие антитела, регистрированные в NCACC под номерами 84111301 и

о

ОЭ

1

ОБ 1

о

84111302 клеточных культур (предпочтительно NCACC № 84111301).

Необходимое всякий раз количество первого и второго антитела для опре- деленных препаратов антител можно легко определить с помощью небольшого количества предварительных опытов. Предпочтительно используют по меньшей мере 5 мкг/мл, бопее предпочтительно по меньшей мере 20 мкг/мл первого мо- ноклонального антитела и по меньшей мере 1 мкг/мл, более предпочтительно по меньшей мере 5 мкг/мл второго мо- ноклонального антитела.

Применяемые моноклональные антитела могут быть получены путем иммунизации подопытных животных с помощью естественной или модифицированной С -амилазы слюны, слияния В-лимфоцитов полученных таким образом иммунизированных животных с трансформируемыми реактивами, клонирования и культивирования образованных таким образом гибридных клеток, которые производят моноклональные антитела, и путем изолирования последних. Пригодными животными для производства антител ОС-амилазы слюны являются крысы и мыши.

I

Иммунизация осуществляется или с помощью естественной человеческой Ct-амилазы слюны или с помощью модифицированной амилазы слюны. Ксли используют естественный фермент, го для этого пригодны стандартные, -элекгро- форетические гомогенные.1 препараты. Химически модифицированная о/-амилаза слюны может быть также помучена в соответствии с известными методами модификации фермь. тон (опубликованная заявка ФРГ N° 254 : 994). Пригодными модифицирующими средствами ИР.ЛНЮГСЯ, например, N-броминтарннмнл (NBS) при окислении гругч: гримгофана в протеине (ВВА 143 (1967) 46Л-472), карбок- симетилирование с эфиром иочукоуснон кислоты (1АА), которое н основном воздействует на гисчидин, ичи нитрирование с те граннтроме i -нюм (TNM) (J. Biul. Chem. 238 (1963) И07), а гакхсе лиазотировлние с чы о ( иропан- ной сульфанилопон киспог.-и (Mi th. Enzymul.(25 /1972) ). При это наиболее подхочятми мп тфптфппл нныи с помощью TNM фсрмым ii ,Mi ni hivib юна нии полевых (лесных) м ши ,i н т ,-- тесгвенныи ф«.-рмеш при п,-н i . «мчл жт

ДОМОВЫХ МЫШеН.

5

0 5

0

5 0 5 0 5

Иммунизация осуществляется путем обычного введения естественного или модифицированного фермента в комбинации со стимулятором. В качестве стимулятора используется гидроокись алюминия в сочетании с бактерией (возбудителем коклюша Борде - Жангу). Если для иммунизации используется естественная Ь -амилаза слюны в домовых мышах или TNM-модифицированная К-ами- лаза в полевых (лесных) мышах, то иммунизация осуществляется преимущественно в течение 9 мес, с помощью по меньшей мере семи иммунизации (инъекций I.Р.).

После проведенной иммунизации происходящие из костного мозга лимфоциты иммунизированных животных соединяются обычными методами с трансформирующими агентами, например клетки миеломы, трансформирующие вирусы, например вирус Эпштейна-Барра или описанные в выложенной заявке ФРГ № 3245665 агенты. Соединение осуществляется в соответствии с известными способами Келера и Мильштейна (Nature 256 (1975) 495-497). Образованные при этом гибридные клетки клонируются обычным образом, например с применением стандартной клеточной породы, и полученные клоны, которые образуют желаемые моноклональные антитела, выращиваются. По причине напоминающего рак роста Гибридных клеток последние можно продолжать культивировать в течение неопределенного времени и производить желаемое моно- клональное антитело в любом коли- чес гве.

Дг1я предлагаемого способа определения могут применяться описанные моно- клон.шьные антитела или имеющие их соответствующие иммунологические свойства фрагменты (фаб-фрагменты). Поэтому под понятием моноклональные антитела и данном случае понимаются и фрагменты. Как комплексное антитело, так и его фрагменты, могут использоваться в иммобилизированной форме.

Определение С -амилазы осуществляется в соответствии с известными для этих целей методами. Так как комбинация моноклональных антител селективно подавляет К-амилазу слюнного тина и она таким образом позволяет определять активность фермеша, не причиняя ущерба ферменту поцжслудочной железы, полученные при определении й(-амилазы в присутствии моноклонального антитела величины соответст

вуют подобающей только ферменту поджелудочной железы активности.

Предлагаемый способ реализуется предпочтительно с помощью системы для обнаружения о(.-амилазы, которая содержит мальтополиозу с 4-7 остатками глюкозы в молекуле, мальто- фосфорилазу,-фосфоглнжомутаэу, глю козо-6-фосфатдегидрогеназу и дифос- фопиридиннуклеотид.

Другая предпочтительная система обнаружения ь(-амилазы состоит из модифицированного с помощью определяемых групп крахмала. Понятие модифицированный крахмал охватывает, например, крахмал, который модифицирован с помощью определяемых групп, например, стандартный продукт под названием Phadebas фирмы Фармациа (Швеция), или описанный в выложенной заявке ФРГ № 2812154 продукт, или изменившийся в процессе распада крахмал, например карбоксиметилкрахмал и предельные декстраны (все эти системы известны).

Для реализации предлагаемого способа исследуемая жидкость или вначале инкубируется с помощью использованных в способе антител и затем используется непосредственно в обычном испытании амилазы, или добавляется в смесь антител с реактивом обнаружения амилазы и затем после инкубации начинается определение путем добавки субстрата. Продолжительность периода инкубации зависит от активности использованных антител и составляет от 0,5 до 10 мин, в частности примерно 5 мин.

Поскольку отделение 66-амилазы слюны оказывается желательной, то одно из моноклональных антител, как в комплексной форме, так и в ф-рме фрагментов, может существовать зафикси-i рованным на твердом носителе, например на иммуносорбционной бумаге или на поверхности трубочек из синтетического материала или гибких трубочек. Таким образом -амилаза слюнного типа привязывается к носителю (т.е. твердая фаза).

Моноклональные антитела, которые удельно подавляют человеческую лазу слюны максимум до 93%, очищаются путем осаждения (NHy) SOy и с помощью DEAE-хроматографии в соответствии с обычными методами. Также очищается моноклональное антитело, которое удельно связывает человеческую -амилазу слюны. Моноклональное антитело или моноклональные антитела смешиваются в растворе с человеческой амилазой и эта смесь инкубируется в

g течение 5 мин при комнатной температуре. Затем эта смесь добавляется к реактиву амилазы и измеряется актив- ность амилазы. В качестве контроля служит амилаза, которая смешана с

5 буфером без моноклонального антитела. Альтернативное моноклональное ан титело или моноклональные антитела добавляются в часть реактива амилазы, раствор глюкозидазы. Затем добавляет0 ся раствор амилазы и смесь инкубируется в течение 5 мин. Начинается реакция с субстратом - G-iPNP (Р - нитро- фенилмальтогептаозид). В качестве контроля служит раствор глюкозидаэы

5 без моноклонального антитела,

В табл.1 представлены результаты метода сывороточного начала (смешаны моноклональное антитело и амилаза); подавление человеческой Л-амилазы слю-t

0 ны и поджелудочной железы с помощью подавляющих моноклональных антител NCACC 84122003 (МАК I) или 84122004- (МАК II) и/или связующего моноклонального антитела NCACC 84111301 (МАК III) (в качестве субстрата GyPNP, GA - общая активность, А - активность с моноклональными антителами, RA - остаточная активность).

« Из табл.1 видно, что комбинация подавляющего удельного моноклонального антитела, а также удельно свя- зующего человеческую 0(-амилаэу моноклонального антитела воздействует на

5 синергическое увеличение подавления. Этот эффект не зависит от субстрата. Это обнаруживается как при высокомолекулярном субстрате (окрашенный крахмал), так и при субстратах с коп роткой цепью, например GyPNP (Р - нитрофенилмальтопентаозид). Эффект наблюдается также при субстрате , Слюнная амилаза также подавляется в человеческом организме синергически с помощью двух моноклональных анти5

тел.

Реактив для удельного определения Ot-амилазы поджелудочной железы наряду с -амилазой слюны в жидкостях

организма, в частности в сыворотке, соке двенадцатиперстной кишки, плазме или моче, содержит систему для обнаружения ОС-амилазы и моноклональ- ное антитело против сС-амилазы слюны, которая отличается тем, что содержит первое моноклональное антитело, которое подавляет фермент слюны менее чем до 97%, и используется в комби- нации с вторым моноклональным антителом против « -амилазы слюны, которое подавляет этот фермент менее чем до 10%. Итак, в предлагаемом реактиве содержится система для обнаружени ( -амилазы.

Изобретение способствует простому, быстрому и точному определению -амилазы поджелудочной железы (h-PA наряду с ut-амилазой слюнного типа (h-SA) в жидкостях организма и существенно улучшает тем самым возможности клинической диагностики.

Пример 1. Подавление человеческой К-амилазы поджелудочной желе- зы и слюны с помощью первого МАК (NCACC 84122004) и в комбинации со вторым МАК (NCAAC 84111301); метод сывороточного начала.

Реактив (буфер) 100 млмоль РО и 150 млмоль NaCl, 6% сывороточного альбумина крупного рогатого скота, рН 7,1.

Реактив амилазы: GfPNP (Бёрингер, Мангейм, номер заказа по каталогу 568569, 37вС).

МАК 1: 0,63 мг/мл первого МАК в буфере.

МАК 2: 0,63 мг/мл первого МАК и 0,105 мг/мл второго МАК в буфере.

МАК 3: 0,105 мг/мл второго МАК в буфере.

При этом, h-SA - 3000 мочевины/л (GTPNP) в буфере, h-PA - 3000 мочевины/л () в буфере.

100 мкл человеческой об-амилазы слюны или поджелудочной железы смешивают со 100 мкл буфера или различных растворов моноклональных антител и в течение 5 мин инкубируют при ком натной температуре. Затем 25 мкл эти смесей добавляю- к 1000 мкл поддерживаемого при постоянной температуре 37°С реактива амилазы и в соответствии с инструкцией определяют активность амилазы. Остаточную активность рассчитывают по формуле-RA,% Активность с МАКс .пп „

ш .-.-.------.----.--.ж-- , 1 Y9

. i Активность без МАК

jg J5

20

25

30

«

40

45

-Q

5

Соответствующие остаточные активности человеческой «/-амилазы слюны составляют с первым МАК 8,6%, со вторым МАК 96,9% и с обоими МАК 2,7%, остаточные активности человеческой 0(.-амилазы поджелудочной железы соответственно составляют 100,1, 99,6 и 99,7%.

Пример 2. Подавление амилазы с помощью первого МАК (NCACC 84122003) и/или второго МАК (NCACC 84111301), вариант сывороточного начала.

Реактивы аналогичны используемым в примере 1, только изменены МАК 1 и МАК 2,(

МАК 1 : 0,525 мг/мл первог9 МАК в буфере,

МАК 0,525 мг/мл первого МАК и 0,105 мг/мл второго МАК в буфере.

Опыт проводят аналогично примеру 1,

Остаточные активности человеческой tf-амилазы слюны составляет с первым МАК 9,1%, со вторым МАК 96,9% и с обоими МАК 2,5%, ocTatO4m ie активности человеческой 0 -амилазы поджелудочной железы соответственно составляют 99,9, 99,6 и 99,7%.

П р и м .е р 3. Подавление человеческой ОС-амилазы слюны и поджелудочной железы с помощью первого МАК (NCACC 84122004) со вторым МАК или без него (NCACC 84111301), метод субстратного начала.

Реактивы: буфер, человеческая 6(- амилаза слюны (h-SA) и человеческая

-амилаза поджелудочной железы (h-PA) как в примере 1.

МАК 1Н: первое МАК в буфере, различные концентрации.

МАК 2Н: второе МАК в буфере 0,513 мг/мл.

При этом, К-глюкозидаза из реактива амилазы (Верингер, Мангейм, номер заказа по каталогу 568569), субстрат из реактива амилазы.

К 880 мкл W-глюкоэидазы добавляют 100 мкл раствора МАК 1 , а также 10 мкл раствора МАК 2й или 10 мкл буфера. К этой смеси подмешивают 25 мкл человеческой {/-амилазы слюны или поджелудочной железы. Эту смесь в течение 5 мин инкубируют при 37вС. Затем путем добавки 100 мкл раствора субстрата происходит начало и осуществляется в соответствии с инструкцией определение активности амилазы.

В качестве контроля служит смесь II- глюкозидазы с 20 мкл буфера, а также соответствующей амилазы. Активность с моноклональными антителами, поде- ленная на активность без моноклональ- ных антител, дает остаточную активность (в процентах).

Результаты опытов для различных концентраций сведены в табл.2.ю

Данные табл.2 свидетельствуют о том, что используемые концентрации антител позволяют с высокой точностью определять ЙС-амилазу поджелудочной 15 железы (по известному способу лишь

90%). Формула изобретения

Способ определения вС-амилазы поджелудочной железы в биологических20

жидкостях, включающий добавление мо- ноклоналышх антител против tf-амнла зы слюны к исследуемому материалу с последующей регистрацией С -амилазы поджелудочной железы, отличающийся тем, что, с целью повышения точности способа, в качестве мо- ноклональных антител используют антитела штаммов САСС № 84122003 или САСС V 84122004 в концентрации 5 - 20 мкг/мл с активностью связывания -амилазы слюны более 97%, далее дополнительно добавляют вторые монокло- нальные антитела против tf-амилазы слюны штаммов САСС № 84111301 или № 84111302 в равном объеме и концентрации 1 - 5 мкг/мл с активностью связывания фермента более 10%, смесь инкубируют в течение 0,5 - 10 мин.

Изобретение относится к иммунологической диагностике Ы.-амилазы поджелудочной железы наряду, с определенным «(-амилазы слюны. Цель - повышение точности определения 0(-амилазы поджелудочной железы. Для этого к исследуемому материалу добавляют моно- клональные антитела штаммов САСС № 84122003 или САСС № 8412204 в концентрации 5-20 мкг/мл с активностью связывания flt-амилазы слюны более 97%. Далее добавляют дополнительно вторые моноклональные антитела против с -ами- лазы слюны штаммов САСС № 84111301 или № 84111302 в равном объеме и концентрации 1 - 5 мкг/мл с активностью связывания фермента более 10%. Смесь инкубируют 0,5 - 10 мин при 20 - и рН 7,1. Точность определения возрастает до 100,2%, по прототипу 90%. 2 табл. i (Л

Показатели . МАК I

МАК I МАК III МАК III МАК I/Ill МАК I/Ill

МАК - концентрация в опыте, мг/л

20

Таблица I

Таблица 2

5/1

20/5