Способ определения гамма-интерферона в лейкоцитах человека Советский патент 1993 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к медицинской вирусологии, в частности к способам определения лейкоцитарного человеческого интерферона.

;Целью изобретения является повышение чувствительности определения гамма- интёрферона в лейкоцитах детей.

Поставленная цель достигается тем, что в известном способе с помощью индуктора интерферона - вируса гриппа А/РР/8, вносимого в культуру лимфоцитов детей и дальнейшего их культивирования в среде 199 или игла с 10% аутоплазмы, согласно изобретению индуктор - вирус гриппа после внесения в культуру отмывают от клеток через 4-6 ч культивируют клетки в течение 4 ч при; температуре 40°С, затем добавляют раст|вор цистеина на 2-2,5 ч, а после его удаления клетки выдерживают в течение 18-2J4 ч при температуре 30-33°С в указанных средах с рН 8,0-8,2-.

Культивирование лейкоцитов после индукции вирусом.гриппа проводят притемпе- ратуре 40°С, что увеличивает скорость синтеза информационных РНК как для альфа-, так и для гамма-интерферона.

Вводимый в реакцию раствор цистеина 0,15-0,2- меняет структуру гликопротеидов мембран лимфоцитов, способствуя выходу более высокомолекулярных белков.

Понижение температуры и изменение рН в сторону 8,0-8,2 дифференцирует выход из клетки гамма-интерферона по отношению к альфа-интерферону,

Вновь введенная совокупность признаков дает возможность выявлять способность продуцировать ин витро иммунный интерферон в ответ на вирусный интерфероноген, что обеспечивает более ранний и повышенный выход количества гамма-интерферона лейкоцитов.

Способ осуществляется следующим образом,

Ј

00

о

ю

со ю

00

У ребенка берут кровь в гепарин в объеме 0,4 мл (из вены или лучше из пальца), выделяют клетки белой крови центрифугированием при 1000 об/мин в течение 15 мин, разводят из расчета 100-200 тыс. в 0,4 мл (2.5Х105), вносят вирус гриппа А/РР/34/Н1№1/1 из расчета 50-100 ЭИДзо на клетку и культивируют в течение 4-6 ч в среде Игла (или 199) с 10% аутоплазмы, не содержащей собственного интерферона, температура инкубации в этой стадии 37°С. Далее лейкоцитарную взвесь отмывают от неадсорбированного вируса центрифугированием в указанных выше условиях, разводят в аналогичной среде без вируса и помещают на 4 ч в термостат при температуре 40°С. Спустя указанное время и культуре лейкоцитов добавляют 0,15-0,2% раствор цистеина, взвесь выдерживают 2,0-2,5 ч при температуре 40°С, осаждают клетки, ресуспендируют их в среде Игла с 10% аутоплазмой и культивируют в дальнейшем 18-24 ч при температуре 30- 33°С при рН 8,0-8,2.

Предлагаемый способ по сравнению с прототипом имеет следующие существенные отличия. Полученная после постановки предлагаемым способом индукции интерферона в лейкоцитах детей вирусным индуктором интерферона (25-36,5 ч индукции) надосадочная жидкость после инактивации остаточного вируса-индуктора антисывороткой - содержала темпера- турно- и кислотолабильный интерферон, инактивирующийся к гамма-интерферону. Имеет место принцип получения такого интерферона (с активностью 200-2000 ME) с применением ряда новых, отличных от прототипа методических отличий, т.е. 4-х часовое инкубирование при температуре 40°С ведет к более выраженному синтезу и РНК и белка, причем время инкубации ограничивает выход основной массы синтезируемого к этому времени интерферона.

Добавление препарата аминокислоты - цистеина по известным нам причинам усиливает выход гамма-интерферона за счет изменения пространственной конфигурации гликопротеидов мембран, меняющих ее транспортные характеристики.

Последующее инкубирование прайми- рованных лейкоцитов при температуре 30°С в условиях рН 8,0-8,2 менее разрушает выходящий из клеток у-интерферон.

Преимуществами предлагаемого способа получения ин витро гамма-интерферона является ряд важных моментов. Во-первых, при необходимости обследования ребенка на способность его лейкоцитов продуцировать гамма-интерферон трудно получить

ощутимые количества этого типа интерферона, так как используется минимальное количество лейкоцитарных клеток (2-5x105) мл. Как индуктор интерферона в такого рода

исследовании (на определение интерферо- ногенного статуса по гамма-интерферону) целесообразно использовать вирус, могущий инфицировать человека, но не актуальный в настоящий период, в этом случае мы

более приближаемся к истинным показателям в отличие от использования различных лектинов или энтеротоксинов грамм-положительных или токсинов грамм-отрицательных бактерий.

5 Штамм вируса А/РР/8 явился в разрабатываемом способе наиболее сильным ин- терфероногеном из группы вирусов гриппа, испытанных нами. Во-вторых, использование температуры 40°С в начале индукции

0 более отражает условия синтеза и-РНК (для гамма-интерферона) и самого интерферона при инфекционном процессе у детей с наличием выраженной лихорадки. В то же время ряд методических приемов, хотя и не отра5 жают условий инфекционного процесса, однако способствуют максимальному синтезу и выходу этого типа интерферона.

П р и м е р. У ребенка В.И; при определении интерферона по прототипному спо0 собу титра интерферона в культуре лейкоцитов в его крови на 1 сут 1:40; 2 сут 1:80; 3 сут 1:80. По тестам на гамма-интерферон при обработке рН титры его стали соответственно 1:40, 1:80, 1:10, однако по5 еле обработки антисыворотки к альфа-ин- терферону его активность резко упала до 1:10, 1:10, 1:Ю.

При определении интерферона по заявляемому способу титры были соответствен0 но 1:320, после обработки рН 5,0 1:10, сыворотка к гамма-интерферону снимала активность интерферона до 1:10, при обработке сыворотки к альфа-интерферону 1:320.

5 Значимость предлагаемого способа выявления гамма-интерферона при его индукции в лейкоцитах не вызывает сомнений, При возможном лечении интерфероном различных вирусных инфекций выяснение ин0 терферонового статуса, т.е. наличие в крови различных типов интерферонов, а также способности лейкоцитов к их продукции крайне важно для определения оптимальных схем йнтерферонолечения. Кроме того,

5 изучение интерферонового статуса необходимо при различных иммунодефицитных состояниях (включая СПИД), где. страдает, главным образом, функция синтеза гамма- интерферона, как основного интерферонового иммуномодулятора иммунитета

организма. Особенно важно значение разработанного способа для определения гамма-интерферона у маленьких детей, учитывая необходимость взятия минимального количества крови, а также роли интер- ферона в системе гормонов роста, регулирующих рост и развитие ребенка.

Формула изобретения Способ определения гамма-интерферо- на в лейкоцитах человека путем выделения лейкоцитов из крови, ресуспендирования в питательной среде, внесения в среду индуктора - вируса гриппа, культивирования индуцированных лейкоцитов с последующим отделением культуральной жидкости и биологическим тестированием в ней активности гамма-интерферона, отличающий- с я тем, что, с целью повышения точности определения гамма-интерферона в лейкоцитах детей, в качестве индуктора используют вирус гриппа штамма А (РР8), культивирование в присутствии вируса проводят при 37°С в течение 4-6 ч, далее лейкоциты отмывают от неадсорбированного

вируса и инкубируют в питательной среде при 40°С в течение 4 ч, после чего в среду вносят 0,15-0,20%-ный раствор цистеина и дополнительно инкубируют при 40°С в течение 2,0-2,5 ч, отмывают, культивируют в питательной среде при температуре 30°С, рН 8,0-8,2 в течение 18-24 ч.

Изобретение относится к медицинской вирусологии, в частности к способам опре- дел|ения лейкоцитарного человеческого ин- тер ферона. Целью изобретения является повышение чувствительности определения гам|ма-интерферона в лейкоцитах детей. Цель достигается тем, что для выявления максимальных концентраций продуцированного ин витро интерферона в ответ на вирусный интерфероноген предлагают использовать в качестве последнего вирус А/РР8/Н1М 1, культивировать лейкоциты в присутствии вируса при 37°С в течение 4-6 ч с дальнейшей индукцией при 40°С в течение 2-2,5 ч и последующим добавлением раствора цистеина на 2-2,5 ч с выделением клеток в течение 18-24 ч при температуре 30-33°С после удаления последнего. Положительный эффект способа заключается в возможности определения гамма-интерферона у маленьких детей.