Способ диагностики вторичного иммунодефицита при хронической НВ-вирусной инфекции у детей Советский патент 1993 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к медицине, точнее клинической иммунологии вирусных инфекций и предназначено для выявления вторичного иммунодефицитного состояния у детей, страдающих хроническим перси- вирусным гепатитом В по со- держ|анию гормона тимуса «1 -тимозина в сыворотке их крови.

Среди вирусных гепатитов ведущая роль, в формировании наиболее тяжелых форм, и хронизации процесса принадлежит вирусному гепатиту В (ВГ В).

При ВГ В в патогенезе инфекции важная роль принадлежит особенностям им- муннрго ответа заболевшего, приводящим к развитию вторичного иммунодефицитного состояния и развитию иммунного цитолиза в печени.

В| последние годы многочисленные исс- ледоцания советских и зарубежных авторов подтверждают факт инициирования НВ-ви- русоЦ иммунокомпетентных клеток (ИКК). Взаимодействуя с мембраной ИКК НВ-ви- рус нарушает их нормальное функционирование, следствием чего является стойкая

иммуносупрессия и формирование хронического процесса.

Характер иммунодефицита при В Г В по существу и определяет клинические особенности болезни и исход заболевания в целом.

Степень выраженности иммуносупрес- сии может определяться не только непосредственным инфицированием ИКК, но и нарушением сложных механизмов иммуно- регуляции.

В этой системе важная роль принадлежит функциональному состоянию тимуса и его гормонам, регулирующим дифференци- ровку ИКК и обеспечивающим их эффектор- ные функции. Нарушение гуморальной активности тимуса неизбежно приводит к дисбалансу Т клеточных популяций и сопровождается той или иной степенью выраженности иммунодефицита.

В экспериментах на иммунодефицит- ных животных и в клинической практике (у больных первичными иммунодефицитными состояниями, ревматоидным артритом, первичным билиарным циррозом печени, красной волчанкой. ХАГ В, карциномой легких.

бронхиальной астмой) лечение препаратами тимусных гормонов приводило к нарастанию числа ауто- и Е-РОК, увеличению выработки иммуноглобулинов, усилению реакции Т-лимфоцитов на митогены.

Среди большой группы известных в настоящее время тимусных факторов большой интерес исследователей и практических врачей привлекает группа высокоочищенных тимусных пептидов из семейства тимо- зинов. таких как тимозины а о, Дз,

По мнению большинства исследователей, основные регуляторные функции в диф- ференцировке Т-лимфоцитов осуществляет а -тимозин, под действием которого образуются Тлф, несущие СД4 маркер (Тлф хел- перы-индукторы).

Таким образом а -тимозин определяет иммунологические феномены, опосредуе- мые Т-хелперами-индукторами:

тимусзависимая продукция антител;

продукция у иа-интерферонов;

выработка МИФ (фактор, ингибирую- щий миграцию лейкоцитов)

синтез инртерлейкина - 2 и др.

Кроме того, а -тимозин, стимулируя образования эритроцитарных рецепторов на лимфоидных клетках приводит к увеличению ауто- м Е-РОК. Механизм действия а -тимозина заключается в экспрессии соответствующих рецепторов на предшественниках Т-хелп.инд.

В последние годы доказана неоднородность данной субпопуляции Тлф и аргументирована ее центральная роль в обеспечении эффективной иммунной реакции клеточного или гуморального типа.

В связи с вышеизложенным содержанием «1 -тимозина в сыворотке крови больных ХВГ В может рассматриваться как показатель состояния Т-клетрчного иммунитета.

В настоящее время диагностика вторичного иммунодефицитного состояния основывается на совокупности клиникоим- мунологич.еских показателей.

Оценка иммунного статуса больного в клинике включает определение общего числа Тлф и основных субпопуляций Тлф хел- перного и супрессорного типов.

Тест розеткообразования с эритроцитами и на сегодня является несомненного надежным и весьма распространенным в клинической практике.

Оценку субпопуляций Тлф хелперного и супрессорного типа проводят также с использованием розеточного теста по наличию поверхностных Fc рецепторов для IgM и IgG (Т и Т лимфоциты) или, чаще всего,

по чувствительности розеткообразующих

клеток к теофилину (ТФР и ТФЧ лимфоциты).

Все перечисленные методы являются

трудоемкими, требующими дорогостоящих

и дефицитных реагентов, реактивов, содержания лабораторных животных. Кроме того, для получения взвеси моноклеаров необходим большой объем крови (3 мл), который можно взять только путем венепункции. Методы субъективны, так как счет ведется визуально, в связи с чем возможны погрешности счета.

В последнее время используют моно- клональные антитела для определения об5 щего числа Тлф и субпопуляций в методах иммунофлюоресценции и цитотоксическом тесте.

Однако метод имеет также недостатки, связанные с потерей числа Т8 субпопуляции

0 лимфоцитов, возникающей при выделении мононуклеаров из периферической крови. Это приводит к изменению соотношения Т4/Т8, не отражающему истинного положения вещей.

5 Целью изобретения является повышение достоверности, за счет установления нового высокоинформативного показателя иммунологи- ческогостатуса.аименноуровня а -тимозина, в сыворотке крови, при отклонениях которого

0 от пределов физиологической нормы (от 831 до 1475 пг/мл) у детей, больных ХВГ В диагностируют вторичный иммунодефицит.

Установлена связь содержания а -тимозина явлением вторичного иммунодефи5 цита при хронической НВ-вирус инфекции, . подтвержденного другими иммунологиче- скими показателями в сопоставлении с характером клинических проявлений.

Способ осуществляется следующим об0 разом.

Создана тест-система на основе поли- клональных (кроличьих) антител. В основе системы использован метод конкурентного (ИФА), иммуноферментного анализа, когда

5 ДГ жидкой фазы конкурирует за связь с AT, находящимися в комплексе с АГ твердой фазы.

Для построения референс-ряда брали шесть различных концентраций а -тимози0 на от 0,1 нг/мл до 3,2 нг/мл. Контрольными служили пробы, не содержащие антигена и антител. Рабочее разведение сыворотки кролика (IAT) 1:10000. Обязательным условием реакции связывания между АГ и AT

5

была продолжительная инкубация при температуре 4°С. Для предотвращения неспецифического связывания AT в отмывочный раствор фосфатного буфера и в смесь АГ+АТ добавляли 0,1 % объема детергента твин-20.

Реакцию тестировали добавлением антикроличьих антител (2АТ) фирмы Slgma, коньюгированных с пероксидазой в рабочем разведении 1:2000, хромогена-ортофе- нилендиамина и субстрата 30% перекиси водорода. Счет реакции производили на гиультискане фирмы Flow по уменьшению сигнала оптической плотности при 450 нм в .Сравнении с контрольной пробой, не содер- специфического антигена. Продол- )| ительность опыта от начала реакции до фштывания составляет 40 ч.

Одновременно в реакции могут быть ис- рледованы 32 пробы сывороток крови. Ниже Подробно излагается методика определе- н|ия уровня а -тимозина с помощью тест- с|истемы методом конкурентного ИФА.

Порядок работы.

Подготовка необходимых реактивов и г|риборов:

. фосфатный буфер или раствор Хенкса, Nla-фосфоцитратный буфер, ортофенилен- д иамин, 30%-ный раствор перекиси водоро- , твин-20, кроличьи антитела в разв. 1:1, ф -тимозин, конъюгат антикроличьих антител с пероксидазой хрена, пробы сывороток для исследования;

I рН-метр, термостат, холодильник, авто- фтическая пипетка-дозаторе наконечника- Ми, высокосорбционные 96-луночные пластины фирмы Nunk, titiievtek, планшеты для иммунологических исследований Медполимер, мультискан. : Постановка опыта:

Фиксация а -тимозина (АГ) на твердой дрче для последующей инкубации: на 96-лу- нрчную высокосорбционную пластину нано- по 100 мкл в лунку раствор ом -тимозина в|концентрации 1 мкг/мл, в контрольный ряд нйносили по 100 мкл в лунку раствор фосфат- нрго буфера, пластину герметически закрыва- л|} пленкой парафилм им инкубировали в течение 18 ч при 4°С в холодильнике;

: создание рефенс-ряда; в четыре ряда планшета Медполимер наносили по 50 MJOI в лунку раствор а -тимозина в концентрациях 0; 0,1; 0,2; 0,4; 0,8; 1,6; 3,2 мкг/мл и кроличьи антитела в разв. 1:100000 по 50 м|;л в лунку, в смесь добавляли 0,1 % объема те|ин-20;

i получение смеси тестируемых сыворо- TOJK и кроличьих антител (АГ+АТ): в осталь- нфе восемь рядов планшеты Медполимер наносили сыворотки больных в разведении 1:$ по 50 мкл в лунку и кроличьи антитела в разведении 1:10000 по 50 мкл в лунку с добавлением 0,1% объема твина-20; планшету также герметически закрывали и инкубировали в течение 18 ч при 4°С в холодильнике;

перенос смеси АГ+АТ на твердую фазу: пластину 3-кратно отмывали от несвязавше- 5 гося а -тимозина раствором фосфатного буфера с добавлением 0,1% объема твина- 20, на ледяной бане переносили инкубированную смесь стандартных растворов а -тимозина и исследуемых сывороток с 0 кроличьими антителами на твердую фазу высокосорбционной пластины Nunse, пластину герметизировали и инкубировали в течение 18 ч при 4°С в холодильнике;

добавление в реакцию двух антител 5 (конъюгата) антикроличьих антител, с пероксидазой в рабочем разведении 1:2000 с добавлением 0,1% объема твина-20 наносили на предварительно 3-х кратно отмытую от непрореагировавших комплексов АГ+АТ 0 пластину Nunk

тестирование реакции: готовили, раствор ортофенилен диамина, для чего 10 мг вещества растворяли в 10 мл Na-фасфоцит- ратного буфера рН 4,6; затем в раствор до- 5 бавляли 4 мкл 30%-ного раствора перекиси водорода, являющегося для пероксидазы; после 3-х кратного отмывания пластины в лунки наносили по 100 мкл смеси субстрата и хромогена; счет реакции производили на 0 мультискане при длине волны 450 нм;

определение количественного содержания а -тимозина.

По коэффициенту поглощения (ОД) ре- ференс-ряда стандартных растворов а - 5 тимозина) строили калибровочную кривую, с помощью которой графически находили соответствующее количество гормона в исследуемой пробе сыворотки, умножая на кратность разведения сыворотки. 0 Достоверность метода проверили при исследовании аналогичных стандартов гормона и одинаковых проб сывороток в радиоиммунном методе с использованием

меченного I125 а -тимозина. 5

Средний уровень «т -тимозина в сыворотке крови здоровых детей составил 1152 ± 161 пг/мл. Статистическую обработку показателей проводили с использоьани- ем критерия Фишера-Стьюдента (табл.1).

Пределы физиологической нормы тимозин были определены при вычислении среднего арифметического значения 2т (т.е. от 831 пг/мл до 1475 пг/мл), одно5

временно с другими иммунологическими показателями у 24 здоровых детей. Для исследования требуется 0,3-0,5 мл крови, которую можно забирать из пальца.

Клинико-лабораторному обследованию подвергались 137 детей, страдающих ХВГ В (ХПГ). Исследования проводились неоднократно в динамике заболевания.

Определение уровня а -тимозина в сыворотке крови проводили до начала лечения параллельно с оценкой иммунного статуса. При анализе полученных результатов установлено, что содержание а -тимозина в сыворотке крови менее 831 пг/мл и более 1475 пг/мл свидетельствует о вторичном иммунодефиците, что полностью подтверждает клинико-иммунологические показатели.

Кроме того, при сопоставлении уровня а -тимозина и иммунологических показателей у больных ХВГ В (ХПГ) отмечена зависимость характера иммунодефицита от уровня а -тимозина. Так, при содержании а- -тимозина ниже границ физиологической нормы явления вторичного иммунодефицита не сопровождается нарушением физиологического соотношения регулятор- ных субпопуляций Т-лимфоцитов (Т4/Т8).

С другой стороны при отклонении содержания «1 -тимозина выше нормы явления вторичного иммунодефицита сопровождается относительным дефицитом Т-хелперной субпопуляции лимфоцитов. Таким образом, отклонения уровня а -тимозина от нормы свидетельствуют не только о наличии вторичного иммунодефицита, но и характеризуют тип иммунодефицита, что в конечном итоге определяют выбор схемы иммунокор- рекции (табл.2).

Предложенный способ подтверждается примерами, приведенными в табл.3.

Приведенные данные свидетельствуют о высокой информативности предлагаемого способа диагностики с использованием нового иммунологического показателя щ -ти мозина. Преимуществом данного способа является его объективность, в то время как другие методы субьективны (счет ведется визуально). Он также не требует дорогостоящих реагентов, реактивов и содержания

лабораторных животных. Для осуществления способа необходимо небольшое количе-. ство крови (0,5 мл), которую можно забирать из пальца. Кроме того, с помощью этого способа осуществляется диагностика типа

вторичного иммунодефицита, что определяет выбор схемы иммунокоррекции.

Предлагаемый способ может быть рекомендован к применению в детских инфекционных стационарах, что будет способствовать

применению адекватных схем иммунокор- ригирующей терапии и тем самым выздоровлению больного или стабилизации процесса.

Формула изобретения,

Способ диагностики вторичного иммунодефицита при хронической НВ-вирусной инфекции у детей путем исследования крови пациента и определения диагностического показателя, отличающийся тем, что,

с целью упрощения способа, в качестве диагностического показателя используют уровень «1 -тимозина, который определяют в реакции иммуноферментного анализа в сыворотке крови и при значении измеренного

показателя менее 831 пг/мм или более 1475 пг/мм сыворотки крови диагностируют вто- . ричный иммунодефицит.

Использование: клиническая иммунология вирусных инфекций, выявление вторичного иммунодефицитного состояния у детей, страдающих хроническими перси- стирующим вирусным гепатитом В. Цель -упрощение способа, Сущность изобретения: в сыворотке крови определяют уровень а -тимозина и при его значениях менее 831 пг/мл или более 1475 пг/мл диагностируют вторичный иммунодефицит.

40 -Таблица1

Средние показатели содержания а тимозина у здоровых и больных ХВГ В детей

Таблица 2

Иммунологические показатели детей, больных ХВГ в (ХПГ) в зависимости от уровня

а тимизина

ТаЬлицаЗ