СПОСОБ ОЦЕНКИ ЭФФЕКТИВНОСТИ ИММУНИЗАЦИИ ПРИ КУ-РИККЕТСИОЗЕ Российский патент 1995 года по МПК G01N33/48 G01N33/53 

Изобретение относится к медицине и может найти применение при разработке и производстве Ку-риккетсиальных вакцин.

Известны способы оценки эффективности иммунизации при Ку-риккетсиозе по специфическим показателям иммунитета.

Однако они не являются надежными, так как у чувствительных и резистентных к коксиеллам Бернета животных вырабатываются антитела в сравнимых титрах, несмотря на совершенно различное течение инфекции.

Кроме того, применение только этих способов явно недостаточно, поскольку они отражают лишь специфические изменения, происходящие в микроорганизме в результате иммунизации.

Известен способ оценки эффективности иммунизации при Ку-риккетсиозе методом флуоресцирующих антител, который осуществляется путем исследования мазков-отпечатков селезенок лабораторных животных, зараженных коксиеллами Бернета.

Однако этот способ сложен, недостаточно чувствителен и весьма неточен, так как основан на субъективной оценке количества микробных клеток, трудно различимых из-за выраженного полиморфизма и маленького размера в мазках, отличающихся по количеству клеток селезенки на единицу поверхности стекла. Обычно результат микроскопии выражают в условных показателях крестах.

Наиболее близким по достигаемому эффекту к изобретению является способ, позволяющий интегрально оценить эффективность иммунизации при Ку-риккетсиозе и заключающийся в том, что сравнивают температурную реакцию у зараженных коксиеллами Бернета животных, предварительно иммунизированных и неиммунизированных против Ку-лихорадки.

Однако этот способ не является достаточно точным, так как повышение температуры результат сложнейших процессов, происходящих в микроорганизме, включая отделы центральной нервной системы. Кроме того, этот способ продолжителен по времени, измерение температуры следует проводить в течение 15 суток.

Предлагаемый способ повышает точность, чувствительность и ускоряет оценку эффективности иммунизации при Ку-риккетсиозе за счет определения антимикробных катионных белков.

Это достигается тем, что в способе, включающем заражение коксиеллами Бернета предварительно за 28 дней иммунизированных (опытных) и неиммунизирован- ных (контрольных) животных, например, морских свинок, до введения и на 2-3 сутки после введения живых коксиелл Бернета, готовят мазки периферической крови, которые высушивают и под микроскопом по интенсивности окрашивания нейтрофильных гранулоцитов определяют средний цитохимический коэффициент содержания антимикробных катионных белков по формуле: СЦК где а-е количество однотипных клеток с определенной степенью интенсивности окрашивания цитоплазмы нейтрофильных гранулоцитов прочным зеленым;
3-0 степень интенсивности окрашивания цитоплазмы; при снижении значения коэффициента не более чем на 15% по сравнению с исходным, иммунизацию считают эффективной, причем в контрольной группе животных СЦК катионных белков должен быть ниже исходного не менее чем на 25%
Предлагаемый способ был выявлен при изучении функционального состояния нейтрофильных гранулоцитов у животных, зараженных коксиеллами Бернета. Оказалось, что у морских свинок, предварительно иммунизированных антигеном из коксиелл Бернета, отмечалось незначительное снижение СЦК по сравнению с исходным уровнем, в то время как у контрольных неиммунизированных животных этот показатель снижался в значительной степени (более чем на 30% от нормы).

В таблице представлены данные, полученные в этом опыте, где у всех подопытных животных за сутки до введения и затем на 2,3 и 7 сут после введения возбудителя готовили мазки периферической крови, окрашивали их прочным зеленым, затем азуром и определяли СЦК содержания катионных белков в нейтрофильных гранулоцитах. На протяжении 15 дней у иммунизированных и контрольных животных измеряли температуру тела. Часть животных забивали на 7-е сутки и определяли с помощью флуоресцирующих антител (по Кунсу) наличие коксиелл Бернета в селезенках животных.

Как видно из полученных данных у всех опытных животных отмечалось снижение СЦК по сравнению с исходным менее чем на 15% Повышение температуры тела в опытной группе выявилось у двух животных и было кратковременным, что могло быть следствием на введение чужеродного белка. Исследования, проведенные по Кунсу, не выявили наличие коксиелл ни у одного опытного животного, в то время как в контрольной группе температуры тела повышалось у всех свинок и показатели метода по Кунсу были положительны у всех животных.

Полученные данные свидетельствуют об эффективности проведенной иммунизации, причем этот метод позволяет значительно раньше и более точно оценить положительный эффект иммунизации.

П р и м е р 1. Опытной группе морских свинок подкожно ввели по 0,5 мл антигена из коксиелл Бернета 1 фазы в концентрации 0,1 мг/мл. Контрольной группе животных внутрибрюшинно ввели по 0,5 мл физиологического раствора. Через 28 дней обеим группам животных ввели внутрибрюшинно по 0,5 мл 20%-ной суспензии куриного эмбриона, содержащего по подсчетам сотни коксиелл в поле зрения. У каждого животного за сутки до введения и на 2 сут после введения взяли мазки периферической крови. Нефиксированные мазки погрузили на 20-30 мин в забуференный раствор прочного зеленого с рН 8,1-8,2, затем быстро сполоснули водой, высушили и после просмотра в иммерсионной системе микроскопа по интенсивности окрашивания гранул определяли СЦК у опытных (СЦК₁) и контрольных (СЦК₂) животных по приведенной формуле.

После подсчета было выявлено, что на 2 сут СЦК₁ 1,62 ± 0,05, СЦК₂ 1,01 ± 0,04. Снижение показателей менее чем на 15% от исходного (1,76 ± 0,05), а в контрольной группе более чем на 25% от исходного (1,79 ± 0,04) свидетельствует о эффективности проведенной вакцинации. Отрицательные данные, полученные при измерении температуры тела и методом Кунса, подтвердили этот вывод.

П р и м е р 2. Морским свинкам из опытной группы ввели подкожно по 0,5 мл антигена из коксиелл Бернета в той же концентрации, а контрольным аналогичным способом по 0,5 мл физраствора. Через 28 дн. всем подопытным животным ввели внутрибрюшинно по 0,5 мл 20%-ной суспензии куриного эмбриона. У всех животных за сутки до введения и на 3 и 4 сут после введения взяли мазки периферической крови и обработали по предлагаемому методу. Полученные данные показали, что если на 3 сут различия в снижении СЦК у опытных (до 1,68 ± 0,05, т.е. на 2,9% от исходного значения 1,73 ± 0,03) и контрольных (до 1,32 ± 0,04, т.е. на 25% от исходного 1,76 ± 0,04) животных были достоверно значимыми и информативными, то на 4 сут снижение СЦК в контрольной группе (1,59 ± 0,06) составило 10% от исходного и различия в сравниваемых группах на этот срок были недостоверны.

П р и м е р 3. Морским свинкам ввели подкожно по 0,5 мл антигена из коксиелл Бернета в концентрации 0,1 мг/мл (опытная группа) и по 0,5 мл физраствора (контрольная группа). Через 28 дней всем животным внутрибрюшинно ввели по 0,5 мл 20%-ной суспензии куриного эмбриона. Анализ мазков периферической крови, взятой до и на 5 и 7 сут после заражения по предлагаемому способу показал, что величина СЦК на эти сроки как в опытной (1,61 ± 0,06 и 1,80 ± 0,04), так и в контрольной (1,57 ± 0,03 и 1,69 ± 0,07) группах приближались к исходным значениям (1,73 ± 0,03 и 1,76 ± 0,04 соответственно) и статиcтически были не достоверны между собой. В то же время судя по изменению температуры тела продолжительность лихорадки в контрольной группе составила в среднем 3,5 дня, у иммунизированных животных значительного повышения температуры не наблюдалось. Просмотр отпечатков селезенки по Кунсу подтвердил наличие коксиелл Бернета в контрольной (+++) группе и сомнительную реакцию (±) в опытной группе животных.

Таким образом, данные, полученные по предлагаемому способу на 5 и 7 сут после заражения иммунизированных животных не позволяют достоверно установить эффективность проведенной иммунизации.

П р и м е р 4. Опытной группе морских свинок подкожно ввели по 0,5 мл коммерческого антигена Провачека, гетерологичного по отношению к коксиеллам Бернета. Контрольным животным ввели подкожно по 0,5 мл физиологического раствора. Через 28 дней всем подопытным животным внутрибрюшинно ввели по 0,5 мл суспензии коксиелл Бернета. При исследовании предлагаемым способом на 3-и сутки после заражения было обнаружено снижение СЦК как в опытной (0,94 ± 0,04), так и в контрольной (0,95 ± 0,06) группам животных более, чем на 30% от исходного уровня (1,70 ± 0,04) содержания катионных белков, что свидетельствует о неэффективности иммунизации гетерологичным антигеном. Данные о наличии коксиелл Бернета в селезенках подопытных животных, повышение температуры тела и продолжительность лихорадки также совпадают в контрольной и опытной группах, что подтверждает факт, выявленный предлагаемым методом уже на 3-и сутки после заражения.

П р и м е р 5. Морским свинкам из опытной группы подкожно ввели по 0,5 мл антигена из коксиелл Бернета 1-й фазы в концентрации 0,01 мг/животное. Морским свинкам из контрольной группы ввели подкожно по 0,5 мл физиологического раствора. Через 28 дней животным из обеих групп ввели внутрибрюшинно по 0,5 мл 20%-ной суспензии куриного эмбриона, содержащего сотни коксиелл Бернета. Применение предлагаемого способа позволило установить, что снижение СЦК в опытной группе (1,41 ± 0,03) составляет в среднем 22% от исходного уровня (1,71 ± 0,03) по сравнению с контрольной группой, где СЦК снижается (1,04 ± 0,06) на 30% от первоначального уровня (1,70 ± 0,04), что указывает на частичный эффект иммунизации.

В то же время применение известных методов привело к противоречивым результатам: так, повышение температуры тела у опытных животных составило 39,7 ± 0,4^о по сравнению с контрольными животными, у которых температура тела на 7-е сутки была 39,9 ± 0,3^о, продолжительность лихорадки в опытной группе была 3,4 дня, в контрольной 5,0 дней. На отпечатках селезенки методом Кунса не удалось выявить больших скоплений коксиелл, т.е. судя по полученным данным, известные методы не позволяют достоверно установить эффективность защиты животных, и только предлагаемый способ позволяет уловить наличие возбудителя на ранних сроках развития инфекции при иммунизации и достоверно установить эффективность защиты при различных дозах вводимого антигена.

Использование: в области медицины и может применяться при разработке и производстве Ку-риккетсиальных вакцин. Сущность изобретения: предварительно за 28 дней иммунизированных и неиммунизированных животных, например, морских свинок, заражают коксиеллами Бернета, а мазки периферической крови готовят до введения и на 2 3 сут после введения живых коксиел Бернета, которые затем высушивают, и под микроскопом по интенсивности окрашивания нейтрофильных гранулоцитов определяют средний цитохимический коэффициент (СЦК) содержания антимикробных катионных белков по приведенной в описании формуле. При снижении значения не более чем на 15% по сравнению с исходным иммунизацию считают эффективной, при этом в контрольной группе животных СЦК катионных белков должен быть ниже исходного не менее чем на 25% Способ позволяет повысить точность, чувствительность оценки эффективности иммунизации при Ку-риккетсиозе. 1 табл.

СПОСОБ ОЦЕНКИ ЭФФЕКТИВНОСТИ ИММУНИЗАЦИИ ПРИ КУ-РИККЕТСИОЗЕ, включающий заражение коксиеллами Бернета предварительно за 28 дней иммунизированных и неиммунизированных животных, отличающийся тем, что до введения и на 2-3 сутки после введения живых коксиелл Бернета готовят мазки периферической крови, высушивают и под микроскопом по интенсивности окрашивания нейтрофильных гранулоцитов определяют средний цитохимический коэффициент (СЦК) содержания антимикробных катионных белков по формуле

где а е количество однотипных клеток с определенной степенью интенсивности окрашивания цитоплазмы нейтрофильных гранулоцитов прочным зеленым;
3 0 степень интенсивности окрашивания цитоплазмы и при снижении значения коэффициента не более чем на 15% по сравнению с исходным иммунизацию считают эффективной,
причем в группе неиммунизированных животных СЦК катионных белков должен быть ниже исходного не менее чем на 25%