Способ оценки действия лекарственных веществ на развитие помутнения хрусталика Советский патент 1993 года по МПК G01N33/48 

w

Ј

Использование: в медицине, в медицинской биохимии, фармакологии и офтальмологий. Сущность изобретения: проводят измерение скорости выхода белка из хрусталика крысы, помещенного в физиологический раствор при 10-30° С в течение не более 6 ч в сравнении с контролем и при увеличении скорости выхода белка из хрусталика судят о катаральном, а при снижении - об антикатаральном .действиях лекарственного вещества. Предлагаемое изобретение позволяет увеличить чувствительность, точность способа. 1 табл.

Способ относится к медицине, в частности к медицинской биохимии, фармакологии и офтальмологии.

Целью изобретения является повышение чувствительности, точности и специфич- ности способа, уменьшение расхода испытуемого вещества, расширение температурного диапазона для проведения исслё- дований и возрастного диапазона испытуемых крыс.

Поставленная цель достигается тем, что у крыс извлекают хрусталик, помещают его в физиологический раствор с испытуемым веществом и по сравнению скорости выхода белка из хрусталика в опыте и контроле оценивают катарактогенный и антикатарак- тальный эффект испытуемого вещества, В качестве контроля используют второй хрусталик той же крысы, который инкубируют в том же растворе без внесения испытуемого вещества, Если в опыте по сравнению с контролем выход белка из линзы замедляется, то испытуемое вещество относят к группе антикатаральных и, наоборот, ускорение потери белка свидетельствует о каратактоген- ном эффекте.

Отличительным признаком предлагаемого изобретения является измерение скорости выхода белка из хрусталика в среду инкубации - в физиологический раствор. Этот признак является существенным, так как позволяет преодолеть все перечисленные недостатки известного способа. Идея нового изобретения заключается в том, что согласно нашим неопубликованным данным видимому на глаз помутнению хруста- Лика - катаракте - ин витро и ин виво предшествует потеря линзой белков, примем, оказалось, что известные антикатарак- тальные лекарственные средства даже в малых дозах блокируют выход белка в среду инкубации. Мы использовали это явление для разработки нового способа оценки действия вещества на развитие помутнения линзы.

Способ поясняется следующими примерами. Для демонстрации осуществления способа использовали уже известные анти00

о

2

О СО

катарактальные вещества: глазные капли - Сэнкаталин фирмы Такеда кемикая индуст- риес (Япония), вита-йодюроль фирмы Лаборатория Г. Фор (Франция) и квинкас фирмы Алкон (США).

Пример 1. У пятинедельной крысы после декапитации удаляли хрусталик глаза, помещали в физиологический раствор при температуре + 14° С с сэнкаталином, конечная концентрация которого оставляла 0,01 мМ. В контроле находился в физиологическом растворе второй хрусталик той же крысы без лекарственного вещества. Затем спустя 2 ч от начала инкубации оценивали содержание белка по Лоури в среде инкубации - физиологическом растворе и время визуально контролируемого наступления помутнения. Содержание белка в опыте в результате трех определений составляло 56 ±13 мкг/мл, в контроле - 119 ± 23 мкг/мл, время контролируемого наступления помутнения (способ-прототип) в опыте и в контроле не отмечались и составляло 21 минуту.

Таким образом по сравнению с контролем сэнкаталин, конечная концентрация которого составляла 0,01 мМ, согласно предлагаемому способу эффективно задерживает выход белка из хрусталика, хотя согласно известному способу-прототипу помутнение in vitro идет одинакового в опыте и в контроле. Следовательно, предлагаемый способ более чувствительный по сравнению с известным (так как использовалась малая концентрация сэнкаталина), более специфичен по сравнению с известным. Налицотакжеуменьшение расхода ан- тикатарактального препарата (согласно способу-прототипу необходимо использовать около 0,2 мМ сэнкаталина),

Пример 2. У двухмесячной крысы после декапитации удаляли хрусталик глаза, помещали в физиологический раствор при температуре + 30° С с сэнкаталином, конечная концентрация которого составляла 0,01 мМ. В контроле находился в физиологическом растворе второй хрусталик той же крысы без лекарственного вещества. Затем спустя 2 часа от начала инкубации оценивали содержание белка по Лоури в среде инкубации - физиологическом растворе и время визуально контролируемого наступления и помутнения. Содержание белка в опыте в результате трех определений составляло 97 ± 8 мкг/мл, в контроле - 199 ± мкг/мл, использовать визуальный контроль наступления помутнения (способ-прототип) в этом случае нельзя, так как не используются 5-6-недель- ные .крысы и измерение проводят при другой температуре.

Таким образом, по сравнению с контролем сэнкаталин, конечная концентрация которого составляла 0,01 мМ, согласно предлагаемому способу эффективно задерживает выход белка на хрусталик, хотя согласно известному способу-прототипу при данных условиях измерения проводить нельзя. Следовательно, предлагаемый способ более чувствительный по сравнению с

0- известным (так как использовалась малая .концентрация сэнкаталина), более специфичен по сравнению с известным. Налицо также уменьшение расхода антикатарак- тального препарата (согласно способу-про5 тотипу необходимо использовать около 0,2 мМ сэнкаталина), расширение температурного диапазона (сравните + 30° С в новом способен + 16° С- в прототипе)и использование двухмесячных крыс (сравните - 5-60 недельных крыс в способе-прототипе).

Пример 3. В двухмесячной крысы после декапитации удаляли хрусталик глаза, помещали в физиологический раствор при температуре + 10° С с сэнкаталином,

5

конечная концентрация которого составляла 0,01 мМ. В контроле находился в физиологическом растворе второй хрусталик той же крысы без лекарственного вещества, Затем спустя 2 часа от начала инкубации оце0 нивали содержание белка по Лоури в среде инкубации - физиологическом растворе и время визуально контролируемого наступления помутнения. Содержание белка в опыте в результате трех определений со5 ставляло 127 ± мкг/мл, в контроле - 304 ± 45 мкг/мл, использовать.визуальный контроль наступления помутнения (способ-прототип) в этом случае нельзя, так как не используются 5-6-недельные крысы и изме0 рение проводят при другой температуре. . Таким образом, по сравнению с контролем сэнкаталин, конечная концентрация которого составляла 0,01 мМ, согласно предлагаемому способу эффективно задер5 живает выход белка из хрусталика, хотя согласно известному способу-прототипу при данных условиях измерения проводить нельзя. Следовательно, предлагаемый способ более чувствительный по сравнению с

0 известным (так как использовалась малая концентрация сэнкаталина), более специфичен по сравнению с известным. Налицо также уменьшение расхода антикатарак- тального препарата (согласно способу-про5 тотипу необходимо использовать около 0,2 мМ сэнкаталина), расширение температурного диапазона (сравните - 10° С в новом способе и + 14° С- в прототипе) и использование двухмесячных крыс (сравните - 5-6- недельных крыс в способе-прототипе).

Пример 4, У шестинедельной крысы после декапитации удаляли хрусталик гла1 за, помещали в физиологический раствор при температуре +16° С с витайодуролем, конечная концентрация которого составляла, 1 % от объема среды инкубации. В контроле находился хрусталик той же крысы без лекарственного вещества. Затем спустя 1 час от начала инкубации оценивали содержание белка по Лоури в среде инкубации - в физиологическом растворе - и время визуально контролируемого наступления помутнения. Содержание белка в опыте в .результате трех определений составляло 156 ±35 мкг/мл, в контроле - 119 ±23 мкг/мл; время визуально контролируемого наступления помутнения (способ-прототип) в опыте составляло 29 минут, в контроле - 23 минуты (при точности визуальной фиксации помутнения - ± 1 мин).

Таким образом, по сравнению с контролем вйтайодуроль, конечная концентрация которого составляла 1 % от объема среды инкубации, согласно предлагаемому способу не задерживает выход белка из хрусталика, хотя эффективно задерживая согласно известному способу-прототипу помутнение in vitro. С другой стороны, из литературы известно, что вйтайодуроль менее эффективен по сравнению с другими известными антикатарактальными препаратами более того, сейчас в ряде этот препарат исключен из фармацевтического реестра. Следовательно, предлагаемый способ более специфичен по сравнению с извест- ным.. /; .. / .., р .;..

Приме р 5. У крысы, возраст которой составлял год со дня рождения, после декапитации удаляли хрусталик глаза, помещали в физиологический раствор при температуре +10° С с квинаксом, конечная концентрация которого составляла 0,01 мМ. В контроле находился второй хрусталик той же крысы в физиологическом растворе без лекарственного вещества. Затем спустя 2ч от начала инкубации оценивали содержание белка по Лоури в среде инкубации - в физиологическом растворе - и время визуально контролируемого наступления помутнения (способ- прототип). Содержание белка в опыте в результате трех определений составляло 84 ± 34 мкг/мл, в контроле - 123 ± 27 мкг/мл, время визуально контролируемого наступления помутнения в опыте и в контроле было одинаковым и составляло 19 мин.

Следовательно, по сравнению с контролем квинакс в дозе 0,01 мМ статически

достоверно не задерживает выход белка, определить его антикатарактальный эффект с помощью известного способа-прототипа визуально в такой малой дозе также невозможно, Обращает на себя внимание тот факт, что сэнкаталин в тех же дозах (пример 1) задерживает потерю линзой белка. Следовательно, сэнкаталин - более эффективное антикатарактальное средство по

сравнению с квинаксом, что получено подтверждение в ряде работ.

Таким образом, по сравнению с известным способом-прототипом 2 новый способ обладает большей специфичностью, более чувствительный (так как ист пользовалась малая концентрация квинакса и сэнкаталина). Налицо также уменьшение расхода антикатарактального препарата (согласно способу-прототипу

необходимо использовать около 0,2 мМ сэнкаталина), расширение температурного диапазона (сравните + 10° С в новом способе и + 14 С - в прототипе) и использование Kpbic 1-годичного возрасте (сравните 5-6-недельных крыс в способе-прототипе).

П р и м е р 6. У шестинедельных Крыс после декапитации удаляли хрусталик глаза, помещали в физиологический раствор

при температуре + 16° С с квинаксом, конечная концентрация которого составляла 0,1 мМ. В контроле находился второй хрусталик той же крысы в физиологическом растворе без лекарственного вещества.

Затем спустя 30 мин от начала инкубации оценивали содержание белка по Лоури в среде инкубации-в физиологическом растворе - и время визуально контролируемого наступления помутнения. Содержание

белка в опыте в результате трех определений составляло 20 ±15 мкг/мл, в контроле - 161 ± 20 мкг/мл, время визуально контролируемого наступления помутнения (способ-прототип) в опыте и в контроле

было почти одинаковым и составляло 18 мин для опУта и контроля соответственно. Таким образом, по сравнению с контролем квинакс в дозе 0,1 мМ явно задерживает выход белка, определить его

антикатарактальный эффект с помощью известного способа-прототипа визуально в такой дозе невозможно из-за интенсивной прокрашиваемое™ линзы в опыте. С другой стороны, по сравнению с примером

5 все же доказан антикатарактальный эффект квинакса. Следовательно, предлагаемый способ более точный по сравнению с известным.

Замечательно также то, что с его по-Отдельно следует остановится на воспмощью Можно проводить оценку антиката-роизводимости предлагаемого способа. В

рактального действия вещества в малыхтаблице приведены средние значения и укадозах, что невозможно в случае прототипа.зали ошибку в определении скорости выхо(пример1). Наконец, с помощью нового спо- 5да белка выхода белка в присутствии 0,01

соба можно проводить оценку антикатарак-мМ сэнкаталина (опыт) и без какого-либо

тальной эффективности различныхлекарственного препарата (контроль) при

веществ, осуществлять подбор лечебной до-инкубации в физиологическом растворе при

зы (примеры 5 и 6). +16 С хрусталика шестинедельных крыс.

В качестве катарактального вещества 10Скорость выхода бел ка(мкг/млв 1мл за

нами был использован пипольфен. который1-й ч инкубации) при инкубации в физиолосогласно данным работы может обладатьгическом растворе при + 16° С хрусталиков

катарактогенным эффектом. ; J-.шестинедельных крыс.

Л р и м е р 7. У шестинедельных крысИз представленной таблицы можно лег- послбдёкапитаций удаляли хрусталик гла- 15ко убедиться, что при тестировании сэнката- за, помещали в физиологический растворлина при низкой дозе максимальный при температуре + 14°С с пипольфеном, ко-разброс для разных животных одного и того нечная кбнцентрацйя которого составлялаже возраста не превышает 10 %. Это позво- 0,1 мМ. В контроле находился второй хру крысу сталик той же крысы в фйзиолргичеЬком 20для онределенйя «атарактального или, нао- растворе без лекарственного вещества. За- ;борот, антикатарактальногр эффекта у тестем спустя 30 мИйут Ьт начала йн(су6аЦййтируемого вещества, Предлагаемый способ оМё«И вали содержание белка по ЛоурЙ Ь дОценки действия вещества на развитие ка- Средё инкубации физирлоги ёс применить и тйоре иврёмйШзу;альнбконт и инсти- НйбТу ЛёнИя помутнения. Содержание 6iert-Tyiax/где проводится активный ка в ofiyte в результате определенийконсервативных методов лечения помутне- сОСтавляло 125 ± 39 мкг/мл, в контрой - ё5нйя хрустаяйка у человека и животйых, .Qnvi- ±31 мкг/мл, йцзёмй визуально контролйруё-саннуй способ может также оказаться bfo ЙёступЛёнйя т о у нейия

) в/6г1ы ё и в контроле... был р ; -.;; лекар ств-.f:-..,.:,v.-;.:.-1.. :;..; .; , -.. : ; ;

о й ёкб&Ш исЬсгйвлялйi кЬло 16 мин; yj ; Ф о р мул а из о б ре т е н и я

fa Спосрб оценки действия лекарственных

лейийпольфенвдозеОИ мМ явно(ускоряет(веществ на развитие помутнения хрустали- , определить его антиКатара

тальицй эффект с г ьмо1Ць1о йзвёетйбго chp ;|дейия его в физиологический раствор с

c 6a-ffpc ifbtHna вйзу /1ьн6 в таквеществом,

.::нево зможйЬ.: : : - .-/К 1: : : ..::.: 1-У,,, 6:Тгл. й ч a.:ik Ш й.й :с и;тем, что, с цел.ыо

лёдчэвате ьнб г|редлагаёМыЙ и точности

более чуйстййтёлен по сравнениюсизвест- Щспособа, проводят измерение скорости вы: Н1 ; Щ Н;;/--; :-.:-- Й л : --1: : : .. :- -..хОда белка из хрусталика при 10-30° Св.

МётоДоцёйКИсодержания белка по Лр-течение не более 6ч, с последующим сравури i pSKHo заменить на любой другойi спо-Ненйём с контролем и при увеличении скособ определения белка, например, нерости выхода белка из хрусталика судят о

флуоресцентный (по флуоресценции трип- 45катарактальном, а при снижении - об антитофанилов или с использованием флуорес-катарактаяьном действии лекарственного

рентных меток).вещества. ,