Способ получения гидрофильного анионообменного сорбента для разделения биополимеров Советский патент 1993 года по МПК C08F220/34 C08F8/32 C08J5/20 B01J20/30 

Изобретение относится к новым анио нообменникам для высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), в частности к буферирующим гидрофильным анй- онообменникам, содержащим в качестве анионообменной группы различные алифатические аминогруппы, и может быть использовано для разделения белков и других биополимеров методами хроматогрофоку- сирования и ионообменной хроматографии.

Целью изобретения является получение сорбента с повышенной разделяющей способностью по белкам в области рН 4-10.

Для достижения цели в способе получения гидрофильного анионообменного сорбента для разделений биополимеров путем обработки макропористого сополимера 2- гидроксиэтилметакрилата и этилендиметак- рилата, содержащего эпоксидные группы, амином в качестве амина используют полиэтиленполиамин (ПЭПА) с числом аминогрупп, равным 3-7, а обработку осуществляют до достижения обменной емкости сорбента0,25-5,0 мг-экв/г.

Ниже приводятся примеры конкретного осуществления способа.

Пример 1.10г сополимера 2-гидро- ксиэтилметакрилата с этилендиметакрйла- том, содержащего 1,04°м-экв/г эпоксидных групп (Сепарон ХЕМА1000Е), суспендируют тщательно в 50 мл тетраэтиленпентамина (ТЭПА)и оставляют на 120ч при5°С. Смесь фильтруют через стеклянный фильтр и промывают водой. Затем продукт суспен- зируют в 100 мл 0,1М растворе HCI04 и перемешивают во встряхивателе в течение 2 часов при 60°С для гидролиза возможных остаточных эпоксидных групп. Готовый ани- онообменник отфильтровывают на стеклянном фильтре и промывают водой, 2М -Nad,

00

VI

vi

водой, 0,5 М HCI, 2M NaCI, водой, 0,2М NaOH, водой и этанолом. Затем высушивают при комнатной температуре. Ионообменная емкость 2,37 м -экв/г.

Кривая титрования приведена на фиг.1.

Пример 2. Юг сополимера Сепарон ХЕМА 1000Е, содержащего 1,04 м-экв/г эпоксидных групп, перемешивают тщательно с 50 мл 2%-ным ТЭПА в воде и продолжают перемешивание во встряхивателе при 70°С в течение 3 ч. Анионообменник гидро- лизуюти промывают аналогично примеру 1. Ионообменная емкость 1,27 м экв/г.

Примеры 3, 4. Сорбент получают аналогично описанному в примере 1, но с использованием иных аминов: пентаэти- ленгексамина(ПЭГА)и гексаэтиленгептами- на(ГЭГА).

Пример 5-7. Сорбент получают аналогично описанному в примере 2, но с использованием технического ПЭПА, триэ- тилентетрамина (ТЭТА).

В таблице приведены сравнительные характеристики предлагаемых анионооб- менников и известного прототипа.

Далее изобретение иллюстрируется примерами использования предлагаемых анионообменников.

Пример 8. Использование предлагаемого анионообменника для разделения смеси белков методом хроматофокусирова- ния.

Стеклянную хроматографическую колонку размерами 3-150 мм, заполняют ани- онообменником, приготовленным по примеру 2, фракция 20 мкм. Колонку соединяют с системой FPLGR при помощи тефло- новых и титановых соединений. Пользуются УФ-детектором при 280 нм. Анализируют образец белков экстракта Bacillus brevls (1 мг в 0,2 мл стартовом буфере), Анализ проводят при следующих условиях: стартовый буфер 50 мМ TRIS/HCI, рН 9,2, элюент РВ 96К (Фармация, Швеция), разбавленный водой до 1:10 и доведенный до рН 7,4 при помощи HCI, скорость элюции 1 мл/мин, давление 30 атм.

Хроматограмма приведена на фиг.2.

Пример 9. Использование предлагаемого анионообменника для разделения смеси белков методом ионообменной хро- матографии.

Хроматографическая система, колонка и образец по примеру 8. Условия анализа: стартовый буфер А 50 мМ имидазол/HCI, рН 7,3, буфер Б 0,5 М NaCI в буфере А, скорость элюции 1 мл/мин, давление 30 атм,

Хроматограмма приведена на фиг.З.

Пример 10. Использование предлагаемого анионообменника для разделения смеси белков методом ионообменной хро- матографии.

Хроматографическая система и колонка по примеру 8. Анализируют образец белков экстракта дрожжей (2 мг в 0,2 мл стартовом буфере). Условия анализа: стартовый буфер А 50 мМ СНзСООН/NaOH, рН4,8, буфер

Б 1М NaCI в буфере А, скорость элюции 0,5 мл/мин, давление 12 атм.

Хроматограмма приведена на фиг.4. Как Следует изданных таблицы и фиг.1, предлагаемые анионообменники имеют линейную кривую титрования в области рН 4-10, т.е. они имеют буферирующую способность в этой рН области, в то время как сорбент по известному способу имеют буферирующую способность только в области рН

8-11.

Ввиду того, что изрэлектрические точки большинства белков и других биополимеров находятся в также в области рН 4-10, могут предлагаемые новые анионообменники найти широкое применение для аналитического и препаративного разделения этих биполимеров методом хро- матофокусирования. Использование же известного сорбента в хроматофокусировании ограничено, так как редко существуют смеси белков и других биополимеров, изо- электрические точки которых находятся только в области рН 8-11.

Что касается обычной ионообменной

хроматографии, то новая анионообменная группа по сравнению с прототипом позволяет дать другую селективность и также ис- пользовать неожиданные для метода ионообменной хроматографии буферные

растворы и области рН (пример 10, фиг.4). Таким образом новый анионообменник расширяет круг аналогичных материалов для ионообменной хроматографии.

Формула изобретения

Способ получения гидрофильного анионообменного сорбента для разделения биополимеров путем обработки макропористого сополимера 2-гидроксиэтилметакрилата и этилендиметилакрилата, содержащего эпоксидные группы, амином, отличающийся тем, что, с целью получения сорбентов с повышенной разделяющей способностью по белкам в области

рН 4-10, в качестве амина используют поли- этиленполиамин с числом аминогрупп, равным 3-7, и обработку осуществляют до достижения обменной емкости сорбента 0,25-5,0 мг-экв/г.

О

1г

.1

НА

Id 10 JO Вреня ин Фиг.З

Ю 20 30 Ьреня,мт Фиг. 4

Использование: жидкостная хроматог- рафия, разделение белков и других биополимеров. Сущность изобретения: получения гидрофильного анионообменного сорбента обработкой макропористого сополимера 2- гидроксиэтилметакрилата и этилендимети- лакрилата. Сополимер содержит эпоксидные группы. Обработку ведут полиэтиленполиами- ном с числом аминогрупп 3-7 до достижения обменной емкости сорбента 0,25-5,0 мг-экв/г. 1 табл. 4 ил.