Способ очистки щелочной фосфатазы Советский патент 1992 года по МПК C12N9/16 

Изобретение относится к получению очищенной щелочной фосфатазы животного происхождения, которая находит применение в генной инженерии, иммуногистохими- ческих процедурах и иммуноферментном анализе, научно-исследовательской работе.

Цель изобретения - повышение активности препарата щелочной фосфатазы.

Изобретение осуществляют следующим образом.

120мг коммерческого препарата щелочной фосфатазы тюленя с удельной активностью, равной 58-60 ед. на 1 мг белка, растворяют в 20 мМ трис-HCI, рН 7,4, содержащего 1-20 мМ MgCb, 1 мМ СаС, 1 мМ

MnCl2, 0,5 М NaCI. Раствор фермента наносят на колонку с конканавалином А, иммобилизованным на сополимере оксиэ- тилметакрилата и этилендиметилметакри- лата, уравновешенную тем же буфером. После отмывки колонки фермент элюируют стартовым буфером, дополнительно содержащим 50 мМ а-метил-О-маннопиранозида. Все хроматографические процедуры проводят при 4°С. Скорость элюции 30-100 см/ч. Активные фракции объединяют и определяют ферментативную активность по п-нитро- фенилфосфату и концентрацию белка по Лоури, Способ позволяет получить препараты щелочной фосфатазы тюленя с удельной

сл сл

I со vi VJ

31-гинног 11,ю. 3300 ЗБОО РД/МГ белка Применение в ачег.тве полимерного носителя сополимера оксиэтилметакрилзга и этилендимеглкрилята позволяет повысить степень разделения смеси вероятно вследствие дополнительных различий в силе гидрофобных взаимодействий матрицы носителя с присутствующими в разделяемой смеси белками и одновременно заметно увеличить линейную скорость элюции, что сокращает продолжительность хрома- тографического цикла и продолжительность воздействия инактивирующих факторов.

Верхняя граница скорости элюирова- ния 100 см/ч обусловлена снижением степени очистки препарата, тогда как нижняя граница (30 см/ч) - снижением количества перерабатываемого сырья из-за увеличения продолжительности хроматографического цикла.

Неспецифическое связывание удается предотвратить в присутствии 0,4-0,6 NaCI, При понижении концентрации NaCI ниже 0,4 М наблюдается понижение удельной активности целевого продукта. Повышение концентрации NaCI в буферном растворе не приводит к какому-нибудь заметному улучшению качествп щелочной фосфзтазы.

Добзп.-,ение 1-20 м№ McjCh в злюатную систему при десорбции способствует стаби- активной тетрамерной формы щелочной Фосфэтазы тюленя. Верхняя граница концентрации хлористого магния 20 мМ обусловлена снижением селективности разделения и уменьшением значения активности полового продукта, нижняя граница 1 - уменьшением стабильности и активности фермента. Активность целевого продукта до ЗЗСО-3500 ед/мг балка.

Пример 1. 120 мг коммерческого препарата щелочной фосфатазы тюленя с удегьной активностью, равной 58 ед/мг белка, растворяют в 40 мл 20 мМ трис-НС1, рН 7,4, содержащего 10 мМ MgCh, 1 мМ MnCl2. 1 мМ CaCl2. 0,5 М NaCI (буфер А). Раствор фермента наносят на колонку скон- канавалином А, иммобилизованным на сополимере оксиэтиленметакрилата и этилендиметакрилата (26x94 мм), уравновешенную буфером А, и отмывают тем же буфером до А280. равной 0,01-0,03. Фермент элюируют стартовым буфером, содержащим 50 мМ а-метил-О-мэннопиранозида. Хроматографию проводят при 4°С. Скорость элюции - 50 см/ч. Фракции, содержащие ферментативную активность, объединяют и диализуют против буфера А без МпСЬ и СэС1з. Активность полученного препарата щелочной фосфатазы равна 3500 ед/мг белка.

Пример 2. 15 мг коммерческого препарата щелочной фосфатазы тюленя с удельной активностью 58 ед/мг белка растворяют в 5 мл 20 мМ трис-HCI, рН 7,4,

содержащего 1 мМ MgCl2, 1 мМ MnCl2, 1 мМ 0,5 М NaCI (буфер Б). Раствор фермента наносят на колонку с конканавалином А, иммобилизованным на сополимере оксиэ- тилметакрилата и этилендиметакрилата

(9x91 мм), уравновешенную буфером Б и отмывают тем же буфером до А280 0,01-0,03. Фермент элюируют стартовым буфером, содержащим 50 мМ метил-0-маннопиранози- да. Хроматографию проводят при 4°С.

Скорость элюции 30 см/ч. Фракции, содержащие ферментативную активность, объединяют и диализуют против буфера А без MnCl2 и CaCl2- Активность полученного препарата щелочной фосфатазы равна 3300

ед/мг белка.

Пример 3. 120 мг коммерческого препарата щелочной фосфатазы тюленя с удельной активностью 58 ед/мг белка растворяют в 40 мл 20 мМ трис-HCI, рН 7.4,

содержащего 20 мМ MgCte, 1 мМ MnCl2, 1 мМ , 0,5 М NaC (буфер С). Раствор фермента наносят на колонку с конканавалином А, иммобилизованным на сополимере оксиэтилметакрилата и этилендиметакрилата (26x94 мм), уравновешенную буфером С, и отмывают тем же буфером до А280, равной 0,01-0,03. Фермент элюируют стартовым буфером, содержащим 50 мМ метил-О-маннопиранозида. Хроматографию проводят при 4°С. Скорость элюции 100 см/ч. Фракции, содержащие ферментативную активность, объединяют и диализуют против буфера А без и CaCl2. Активность полученного препарата

щелочной фосфатазы равна 3370 ед/мг белка.

Пример 4. 15 мг коммерческого препарата щелочной фосфатазы тюленя с удельной активностью, равной 60 ед/мг

белка, растворяют в 5 мл 20 мМ трис-HCI, рН 7,4, содержащего 0,5 мМ MgCl2,1 мМ MnClz, 1 мМ CaCl2. 0.5 М NaCI (буфер Г)- Раствор фермента наносят на колонку с конканавалином А, иммобилизованным на

сополимере оксиэтилметакрилата и этилендиметакрилата (9x91 мм), уравновешенную буфером Г, и отмывают тем же буфером до А280, равной 0,01-0,03. Фермент элюируют стартовым буфером, содержащим 50 мМ

а-метил-О-маннопиранозида. Хроматографию проводят при 4°С. Скорость элюции 25 см/ч. Фракции, содержащие ферментативную активность, объединяют и диализуют против буфера без MnCl2 и CaCl2. Активность полученного препарата щелочной фосфэтазы равна 2500 ед/мг белка.

Пример 5. 15 мг к9ммерческого препарата щелочной фосфатазы тюленя с удельной активностью, равной 55 ед/мг белка, растворяют в 5 мл 20 мМ трис-НС1, рН 7,4, содержащего 25 мМ MgCl2. 1 мМ MnCl2. 1 мМ CaCl2. 0,5 М NaCI (буфер Д). Раствор фермента наносят на колонку с конканавалином А, иммобилизованном на сополимере оксиэтилметакрилата и этилен- диметакрилата (9x91 мм), уравновешенную буфером Д и отмывают тем же буфером до А280, равной 0,01-0,03. Фермент элюируют стартовым буфером, содержащим 50 мМ а- метил-О-маннопиранозида. Хроматографию проводят при 4°С, Скорость элюции 105 см/ч. Фракции, содержащие ферментативную активность, объединяют и диализу- ют против буфера Д без MnCte и CaCte. Активность полученного препарата щелочной фосфатазы равна 2450 ед/мг белка.

Пример 6. Препарат щелочной фосфатазы тюленя очищают в условиях способа-прототипа хроматографией на кон- канавалине А, иммобилизованном на сефа- розе. Для сорбирования фермента и промывки используют буферную систему: 20 мМ трис-HCI рН 7,5, 1 мМ CaCl2, 1 мМ MnCl2. 0,9% NaCI и 0.05% тритона Х-100. Десорбцию и элюирование фермента осуществляют в той же буферной системе, дополнительно содержащей я-метил-Dманнопирэнозид Р концрмтрлции or нуля до 0,2 М. Линейная скорость ;)люции 7,5 см/ч. Получают препарат щелочной Фосф.чтазы с удельной активностью 1500 ед/мг белка.

Способ позволяет получать активный препарат щелочной фосфатазы тюленя при сокращении продолжительности производительного цикла.

Формула изобретения Способ очистки щелочной фосфатазы, предусматривающий хроматографию ферментного препарата из животных тканей на конканавалине А, иммобилизованном на полимерной матрице, при сорбции в буферной системе, содержащей 20 мМ трис-соля- нокислый буфер рН 7,5. хлористый натрий, 1мМ хлористый кальций и 1 мМ хлористый марганец, и элюировании целевого продукта той же буферной системой, дополнительно содержащей 50 мМ оме- тил-0-маннопиранозид, отличающий- с я тем, что, с целью повышения активности фермента, используют ферментный препарат щелочной фосфатазы из тонкого кишечника тюленя, в качестве полимерной матрицы берут сополимер оксиэтилметакрилата и этилендиметакрилата. в буферную систему для сорбции фермента дополнительно вводят 1-20 мМ хлористого магния, а хлористый натрий используют в концентрации 0,4-0,6 М, элюирование же осуществляют с линейной скоростью 30-100 см/ч.

Изобретение относится к биохимии, а именно к способам очистки щелочной фос- фатазы тонкого кишечника тюленя. Цель изобретения - повышение активности фермента. Раствор, содержащий фермент, хро- матографируют на конканавалине А, иммобилизованном на сополимере оксиэ- тилметакрилата и зтилендиметакрилатэ. Сорбцию проводят раствором 20 мМ трис- HCI буфера рН 7,5, содержащего 0,4-0,6 М хлористый натрий, 1 мМ хлористый кальций, 1 мМ хлористый марганец и 1--20 мМ хлористый магний. Элюирование целевого продукта осуществляют той же буферной системой, дополнительно содержащей 50 мМ -метил-О-маннопирановид, с линейной скоростью 30-100 см/ч. Способ позволяет получать щелочную фосфатазу с удельной активностью 3000-3500 ед/мг белка. сл С