Способ очистки пептидилглициновой @ -амидирующей монооксигеназы и способ получения @ -амидированного пептида Советский патент 1993 года по МПК C12N9/04 

Изобретение относится к биотехнологии и биохимии.

Известен фермент, обладающий а-амидирующей активностью, присутствующий в

свином гипофизе, очищенный с использованием сефагеля-100 до такой степени, что обнаруживает минимальную кажущуюся

молекулярную массу примерно 60000 даль- тон.

Целью объекта изобретения способ очистки а-амидирующей монооксигеназы является улучшение качества и чистоты целевого продукта.

Целью является ускорение способа и повышение выхода целевого продукта.

Предложенный способ обеспечивает очистку а -амидирующей монооксигеназы экстрагированной из раковых клеток меду- лярной железы, в частности, ткани IVI-10028 спинномозговой карциономы крысы или ее клеточной линии IVI-10029, имеющей молекулярную массу примерно от 60000 до 65000 дальтон, в такой степени, что электрофоре- тический процесс, осуществляемый на гелях додецилсульфат натрия/полиакриламид, обнаруживает одну единственную гомогенную четко выраженную полосу, и которая имеет удельную ферментную активность не менее 50 м Ед на мг белка (1 Ед. конверсия . одного миллимоля Дансил-Д-тир-Вал-Гли- COQH в 1 миллимоль Данси-Д-Тир-Вал-Со На в минуту при 37°С и при величине ,0).

Данный фермент был экстрагирован из раковых клеток медуллярной железы крысы, которая была привита крысам WAG/Rij Wistar, как описано Roos В.А. и др., Endocrinology; 1979 г., том 150, № 1, стр. 27-32. Эта ткань хранится под официальным номером 1VI-10028. Данный фермент был экстрагирован также из других источников, главным образом, раковых линий клеток медуллярной железы человека и крысы. Линия клеток крысы 77(74) была выделена из раковых новообразований медуллярной железы крысы путем последовательных операций, как описано Muszynshi M., и др. JBC 1983 г., том 258, стр. 1167-1183. Эта линия клеток хранится под официальным -номером IVI-10029.

Данный фермент выделяют и очищают путем первоначальной обработки, гомогена- та ткани методом ионообменной хроматог- рафии. Так, например, образец может быть подвергнут общей весовой нагрузке в пре- паративной анионообменной колонке, наполненной, например, смолой ДЕ-52, Whatman, Limited. Продукт, содержащий монооксигеназу с а-амидирующей активностью, затем подвергают хроматографии исключения с использованием смолы с подходящей разделяющей способностью, например в колонке с наполнителем Sephacryl S-200 очень сильной степени помола. Фракцию элюента, содержащую активный фермент, затем подвергают обработке методом ионообменной хроматографии с использованием сильно анионообменной смолы. Смола, которая может использоваться для данной цели, представляет собой сильную анионообмен- ную смолу Mono Q HR5/5, поставляемую Pharmacia Fine Chemicals, и для гомогенной очистки фермента может потребоваться один или более проходов через колонку. В каждом этапе очистки может осуществляться контроль как содержания белка, так и степени активности а -амидирования. Данная информация используется для расчета удельной активности фермента, которая служит показателем относительной чистоты

фермента.

Очищенная пептидил-глициноваяа-ами- дирующая монооксигеназа используется для амидирования альфа-карбоксильной группы полипептида, имеющего концевую глициноВуЮ остаточную группу, где глициновая группа функционирует как донор аминогруппы. Пептидный или полипептидный субстрат может быть очищен от естественных источников, синтезированных из составляющих его аминокислот, или может быть получен1 методами рекомбинантной ДНК, Полипептид с концевым глицином соединяется с кислородом в присутствии эффективного количества фермента. Количество

требуемого фермента зависит от различных параметров, хорошо известных, включающих, в частности, (но ограничивающихся ими) следующие: удельная активность данного ферментного препарата, количество и

химическая природа подвергаемого конверсии субстрата, время, в течение которого происходит конверсия, и температура и величина рН реакционной смеси. Специалистам в данной области известны другие

0 .параметры, которые могут влиять на точное количество фермента, требуемого для данного процесса. Кислород обычно используется в стехиометрическом количестве, но избыток кислорода не оказывает вредного

5 влияния на реакцию. Наличие ионов меди также необходимо, и эти ионы могут обеспечиваться любой солью меди, которая не оказывает вредного влияния на реакцию, Когда фермент имеет удельную ферментную ак0 тивность примерно 1 м Eg/мг белка, то максимальное а -амидирование происходит при концентрации ионов двухвалентной меди 4,7 мкМ. По мере.увеличения степени чистоты фермента необходимая концентра5

ция экзогенного иона двухвалентной меди снижается. Ферментная активность может быть увеличена за счет присутствия ионов аскорбата, наличие которых обеспечивается любой солью, пока катион данной соли не

оказывает нежелательного влияния на реакцию. Для очищенного фермента с удельной ферментной активностью примерно 50 м.Ед/мг белка максимальная активность а-амидировзния имеет место при концентрации аскорбата примерно 5,5 мМ. Активность о. -амидирования может быть увеличена путем введения каталазы. Оптимальная величина рН реакции о. -амидирования составляет от 6,5 до 7,5,

Альфа-амидирующая активность очищенной монооксигеназы, отвечающей настоящему изобретению, была продемонстирована с использованием субстрата радиоиодированного Д-Тир-Вал-Гли, пептида, последовательность которого имитирует карбоксильную концевую группу ме- ланноцита,стимулирующего предшественник гормона. Анализы осуществляют в 100 мМол, буферном растворе TES (М-трис(оксиметил)метил-2-аминоэтан- сульф&кислота), ,0, при температуре 37°С в течение трех часов, Продукт, / 1/Тир-Вал-ЬШ2, выделяют из субстрата методом катионообменной хроматографии. Была продемонстрирована также активность амидирующего фермента с использованием синтетического субстрата, который имитировал последовательность карбоксильной концевой группы кальцитонина, /Тир Гли /кальцитонина,и с использовав нием в качестве субстрата фактора высвобождения гормона роста человека, выделенного из рекомбинантного микроорганизма.

Хотя данное изобретение описано со ссылкой на предпочтительные принципы его осуществления, для специалистов в данной области должно быть ясно, что могут быть многие варианты и модификации.

П р и м е р 1. Способ очистки альфа-ами- дирующей монооксигеназы из опухолевых тканей мозговой тироидной карциномы.

Замороженные опухолевые ткани мозговой тироидной карциномы крысы измельчают до крошечных фрагментов и гомогенизируют в 150 мМ Трис, рН 7,5, содержащем 250 мМ сахарозы, 0,25% М-аце- тилглюкопиранозида, 0,1 PMSF, 20 мкг/мл пепстатина и 100 мкг/мл ингибитора трипсина соевых бобов.

Обычно гомогенизируют 25 грамм в опухолевой ткани в 200 мл вышеуказанного буфера на льду. Гомогенизацию осуществляют в четыре импульса по 20 секунд каждый с использованием гомогенизатора Polytron (Brinkman) при установке на 7. Гомогенат подвергают центрифугированию в течение 15 минут при Э.ОООхд в роторе

IA-20 (Beckman), а всплывшее вещество (svp. 1) отстаивается. Осадок вновь гомогенизируют в 60 мл гомогенизационногр буфера в ходе 3 импульсов по 20 секунд 5 каждый при установке на 7, Этот второй гомогенат подвергают аналогичному центрифугированию в течение 15 минут при Э.ОООхд,

Всплывшее вещество после этого цент0 рифугирования (svp.2) соединяют с svp.1. Соединенные svp.1 и svp,2 затем центрифугируют 30 минут при 100.000хд в роторе sw28 (Beckman) при 4°С. К осветленному . гомогенату (svp.3) добавляют достаточное

5 количество кристаллов сульфата аммония для получения 25%-ного раствора сульфата аммония, Добавление кристаллов производят постепенно в течение 15 минутного периода с постоянным перемешиванием

0 гомогената при 4°С. Спустя дополнительно 30 мин перемешивают при 4°С, смесь центрифугируют 15 минут при 27.000хд в роторе IA-20 (Beckman) при 4°С. Всплывшее вещество декантируют и добавляют дополни-«

5 тельное количество сульфата аммония к всплывшему веществу до получения раствора с 40% сульфата аммония. После дополнительных 30 минут перемешивания смесь вновь центрифугируют 15 минут при

0 27.000хд согласно вышеуказанному. Всплывшее вещество после этого центрифугирования отбрасывают, а осадок, который содержит по крайней мере 50% активности фермента в гомогенате, вновь

5 переводят в суспензию в 50 мМ Трис HCI, рН 7,0 для получения пробы. Активность составляет 8,2 mv/мг белка. Затем осуществляют хроматографическое разделение, используя следующие этапы.

0 Гель-фильтрация с сефакрилом S-300.

Вытеснительная хроматография (по размеру).

Сефакрил S-300 (Pharmacia) уравновешивают в 50 мМтрис HCI, рН7,0 и выливают

5 .в колонку К 50/100 (Pharmacia) согласно инструкциям изготовителя. Объем слоя колонки составляет примерно 1,3 литра. Пробу загружают в колонку в объеме, представляющем примерно 3% объема слоя колонки.

0 Белки элюируют из колонки в 50 мМ Трис HCI, рН 7,0, при протоке примерно 2 мл в минуту. Фракции по 10 мл собирают и испытывают в отношении альфа-амидирующей монооксигеназной активности с использо5 ванием субстрата Dansyl-D-Tyr-Vrl-Cly. Фермент, элюированный из колонки в единичном пике активности, характеризуется молекулярной массой от 60.000 до 65.000 дальтон. Активность составляет по крайней мере 50 mv/мг белка.

Моно Q Хроматография при рН 6,0 Сильная анионообменная хроматогра- фия.

Фракции с колонки из Сеф.акрила S-300, содержащие максимальную ферментную активность, сливают и диализируют с использованием 4 литров 20 мМ бис-Трис буфера рН 6,0. Объединенные фракции затем помещают на колонку Моно Q HR 5/5 (Фармация), которая предварительно обрабатывалась в соответствий с инструкциями производителя, и уравновешивались в 20 мМ бис-Трис с рН 6,0. После Tqro, как белки, не связывающиеся с колонкой, собирались в элюенте с колонки (проток через колонку), связанные белки элюируют с помощью 20 мМ бис-Трис с рН 6,0 с линейным солевым градиентом 0-300 мМ NaCI. Колонка работает при скорости протока 0,5 мл в м инуту, и собирают фракции, каждая по 2 мл. Раствор белков, элюируемый с моно Q колонки при рН 6,0, немедленно нейтрализуется путем сбора его в пробирки, содержащие каждая 200 мкл 1,0 М Трис с рН 7,0. Фракции анализируют на альфа-амидирующую моно- оксигеназную активность, как и раньше, и наблюдают пик активности, который элюируют с колонки приблизительно при 160 мМ NaCI. Активность составляла 161 м Ёд/мг белка.

Моно Q хроматография при рН 8,0 Фракции, содержащие пик альфа-ами- дирующей ферментнрй активности, от Моно Q хроматографии при рН 6,0 диализируют с использованием двух обменов каждый по 4 литра 50 мМ Трис HCI с рН 8,0. Фермент затем помещают на Моно Q HR 5/5 колонку (Фармация), уравновешенную 50 мМ Трис HCI с рН 8,0. Белки элюируют в 50 мМ Трис HCI рН 8,0 с солевым градиентом 0-300 мМ NaCI. Используют скорость протока 0,5 мл в минуту, и собирают фракции по 2 мл. Каждую фракцию нейтрализуют добавлением 200 мкл 1,0 М Трис рН 7,0 в каждую из собирательных пробирок. Наблюдают два отчетливых пика ферментной активности при элюировании соответственно при 190 м М NaCI и 220 мМ NaCI. Активности составляют соответственно не менее 80 м Ед/мг белка и 400 м Ед/мг белка.

Электрофоретический анализ чистоты ферментного препарата с использованием окрашенного серебром SDS полиакрила- мидного геля на каждой стадии очистки приведен на ,фиг. 1. Полоса 1: маркеры молекулярного веса (0,5 мкг каждого белка); полоса 2: плавающий на поверхности слой нейтрального экстракта ткани после высокоскоростного центрифугирования (6,9 мкг); полоса 3: осадок 26-46% сульфата аммония

(4,7 мкг) от высокоскоростного отделения плавающего на поверхности слоя; полоса 4: размерно-эксклюзионная хроматография осадка сульфата аммония (4,4 мкг); полоса 5:

анионообменная хроматография при рН 6,0 (0,5 мкг); полоса 6: анионообменная хроматография при рН 8,0.

Полосы 2-6 показывают ферментный состав на последовательных стадиях процесса очистки. Трэк 1 показывает маркеры молекулярного веса и не соответствует ферментному составу. Активность состава, соответствующего трэку 2, равна 2.97х103. Активность состава, соответствующего трэку 3, равна 1,89x10 . Состав, соответствующий трэку 4S имеет активность 1,23x10 , Активность х; состава, соответствующего трэку 5, равна 7,90x10 . Состав, соответствующий трэку 6, имеет активность 2,07 х

х106.%

П р и м е р 2. Получение вещества Р. а -Амидирование биологически уместных / релевантных пептидных гормонов с использованием фермента а -амидирования.

Несколько субстратов рекомбинантно-. го и синтетического пептидного гормона, включающих субстраты лососевого и человеческого кальцитонина, фактов высвобождения человеческого гормона роста, пептид, родственный гену человеческого кальцитонина, и вещество Р человека, получались и успешно а -амидировались с помощью фер- . ментного препарата а -амидирования данного изобретения. Поскольку скорость а-амидирования зависит от первичной структуры субстрата, для каждого пептидного предшественника условия реакции, требуемые для достижения эффективных скоростей а -амидирования, должны оптимизироваться. С целью иллюстрации ниже описана методика, разработанная для а-амидирования предшественника вещества Р.

. Вещество Р является П-членным пептид- ным гормоном, имеющим а -амидирован- ный метионильный остаток на карбоксильном конце. Пептидный предшественник, содержащий последовательность

вещества Р, с растяжением карбоксил-концевого глицила, приготавливался с помощью синтетических методов и использовался в качестве опытного (тест) субстрата для фермента а -амидирования.

при оптимизированных условиях реакции под действием фермента «-амидирования предпоследний метионильный остаток пептидного предшественника быстро превращается в метионин-амид. Соответствующая

процедура данного превращения заключается в следующем. Лиофилизованный пеп- тидный субстрат (растянутый глицином предшественник вещества Р, 300 наномо- лей) растворяется в 100 мкл 150 мМ TES буфера, рН 7. К данному раствору субстрата добавляется 50 мкл (приблизительно 1,2 мЦ) ферментного препарата а-амидйрования. Фермент может происходить или из опухолевой ткани крыс МТС ил из отработанной тканевой культуральной среды от клеточной линии крыс МТС СА-77. Фермент должен очищаться до такой степени, чтобы вся посторонняя протеолитическая активность была удалена. Это обычно достигается с помощью сочетания ионообменной и размер- но-эксклюзионной хроматографии. Реакция а-амидирования затем инициируется путем добавления 100 мкл свежеприготовленной смеси, содержащей этанол (2,5%, объем/объем), каталазу (0,25 мкг/мкл), L-аскор- биновую кислоту (25 мМ) и Твин-20 (0,025% обьем) (объем). Указанная выше реакционная смесь тщательно смешивается и инкубируется при 37°С. Эти реакционные условия обычно дают 100% превращение предшественника вещества Р ва-амидиро- ванный продукт менее, чем за 60 минут. Очистка продукта может быть легко достигнута с помощью обратно-фазной жидкостной хроматографии высокой разрешающей способности,

П р и м е р 3. Фактор высвобождения гормона роста человека (ФВГРч) представляет собой гормон пептида с 44 членами, содержащий альфа-амидированный лейци- ловый остаток на своем карбоксильном окончании. Ген белка слияния для ФВГРч был создан так, что аминокислотная последовательность для гормона пептидз была сгруппирована триптофанильным остатком на его окончании амино-,а на его карбоксильном окончании - глициловым остатком, который также завершал рекомбинантный белок слияния, ФВГРч-содержащий белок слияния изолировали от лизатов рекомби- нантного микроорганизма осаждением. Часть без ФВГРч белка слияния денатурировали путем превращения цистеинильных радикалов в производные S-сульфоната. Так как ФВГРч не содержит триптофана, химическое разложение рекомбинантного белка слияния с реагентом BNPS-скатол расщепляло окислением белок слияния, создавая таким образом неамидированный ФВГРч с карбоксил-терминальным удлинением глицина. Одновременно с этим, мети- ониловый радикал в положении 27 в молекуле ФВГРч окислялся до сульфоксида

метионина. Этот пептид с глициновым удлинением изолировали с использованием гель-фильтрации и жидкостной хроматографии высокого разрешения с обращенной 5 фазой. Его структуру устанавливали аминокислотным анализом фрагмента пептидов, полученных в результате переваривания с использованием трипсина.

Предпоследний радикал лейцила пре0 вращали в лейцинамид с помощью воздействия альфа-амидирующего фермента согласно настоящему изобретению, Пример условий, используемых для приготовления альфа-амидированного ФВГРч, будет та5 ким. Лиофилизированный субстрат пептида (20-40 наномолей) растворяли в 150 мл деи- онизировзнной воды и смешивали с 90 мкл (500 мкед) (рН 7,0) препарата альфа-амидирующего фермента, производного либо из

0 опухоли МТС крысы или из использованной среды для культивирования тканей из клеточной линии СА-77 крысы. Фермент очищали для удаления всякой посторонней активности протеолитического фермента в

5 результате сочетания хроматографии с вытеснением по размеру и ионообменной хроматографии, Добавляли аскорбиновую кислоту и сульфат меди затем к смеси фермента и субстрата в достаточном количестве

0 для получения концентраций в 3 мМ и 2 мкМ, соответственно. Полученный раствор смешивали и инкубировали при 37°С в течение 4-6 ч. Типичный процент превращения субстрата в продукт составляет 95% на ос5 нове аминокислотного анализа фрагментов, высвобожденных при переваривании с трипсином. И, наконец, остаток сульфоксида метионина был восстановлен до метионина воздействием бэта-меркаптоэтанола

0 4М в буфере при рН 4 с Ю.мМ ацетата натрия при 80°С в течение одного часа. Конечный продукт очищали высокоэффективной жидкостной хроматографией с обращенной фазой и характеризовали его

5 временем удержания, анализом триптиче- ского переваривания и аминокислотного анализа. Рекомбинант, альфа-амидированный продукт, также испытывали на биологическую активность, Во всех случаях

0 рекомбинантный ФВГРч был неотличим от синтетического ФВГРч.

Формула изобр е т е н и я 1. Способ очистки пептидилглициновой а -амидирующей монооксигеназы из исход5 ного гомогената ткани животного, отличаю- щ и и с я тем, что, с целью улучшения качества и чистоты целевого продукта, гомогенат подвергают анионообменной, хроматографии и полученную фракцию, содержащую фермент, подвергают хроматографии исключения по размеру с использованием хроматог- рафического носителя, способного к выделению фермента с мол.м. 60-65 кД и удельной активностью не менее 50 мЕд/мг белка, после чего фракцию элюента, содержащую фермент, подвергают сильной анио- нообменной хроматографии.

2. Способ по п. 1, отличаю щи и с я тем, что используют ткань 1V1-10028 спинномозговой карциономы крысы или ее клеточной линии 1V1-10029.

3. Способ получения а-амидмрованно- го пептида, включающий контактирование субстрата с пептидилглициновой альфаа- мидмрующей монооксигеназой в присутствии кислорода и восстановителя с

0

последующим выделением целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью ускорения способа и повышения выхода целевого продукта, субстрат контактируют с монооксигеназой, имеющей мол.м, 60-65 кД и удельную активность не менее 25 мЕд/мг белка,

4. Способ по п. 3, отличающийся тем, что в качестве субстрата используют пептид, получаемый с помощью синтеза ин- витро, или природный пептид, или пол- ипептид, или пептид, или полипептид, получаемый с помощью технологии реком- бинантных ДНК.

Использование: биотехнология, медицина, биохимия, получение лекарственных препаратов. Сущность изобретения: объектами данного изобретения являются способ очистки а -амидирующей монооксигеназы и способ получения а -амидированного пеп- тида. Пептидил-глициновая а, -амидирую- щая монооксидаза представляет собой фермент, экстрагируемый из раковых линий клеток и тканей медуллярной железы, имеющий молекулярную массу примерно 60000-65000 дальтон. Она в такой степени очищена, что использование электрофоре- тической процедуры, осуществляемой на гелях додецилсульфат натрия-полиакриламид обнаруживает единую гомогенную хорошо выраженную полосу, и имеет удельную ферментную активность не менее.50 мЕд на мг белка. Свободный или иммобилизованный фермент в присутствии ионов двухвалентной меди, аскорбата и кислорода может использоватьсядля получения а-амидированного белка из полипептидно- го субстрата, содержащего глициновый радикал с концевой карбоксильной группой. Изобретение охватывает также способ пол- ; учения а -амидирующего пептида из пеп- тидных или полипептидных субстратов, содержащих концевую глициновую остаточную группу, путем химического взаимодействия данного субстрата с кислородом в присутствии очищенного фермента, аскор- бэта или меди. 1 ил. 00 о кэ 00

Mr

1 23456