Штамм гибридомы АТССНВ 9580 - продуцент антител против гликопротеина Советский патент 1993 года по МПК G01N33/531 

Изобретение относится к производству моноклональных антител против протеинов, в частности к способу получения моноклонального антитела производного анти- гликопротеина.

Цель изобретения - получение нового моноклонального антитела анти-гликопротеина, полезного в областях трансплантации органов, прививки ткани, онкологии и для лечения аллергии.

Способ осуществляется следующим образом.

Способ заключается в том, что мышей подвергают двукратной иммунизации клетками JY в среде RPMI с последующей иммунизацией дифференцированными миоистат- ацетатом форбола клетками U937 в той же

среде, клетки селезенки иммунизированных мышей отбирают и сливают с миеломными клетками РЗХбЗАд 8653 с последующей инкубацией слившихся клеток в присутствии сложного эфира миристата форбола и клеток JY или SKW-3, надосадочную жидкость, ингибирующую агрегацию клеток JY, подвергают двукратному клонированию с использованием метода ограниченного разведения с последующей культивацией клонированных клеток в подходящей среде и выделением конечного продукта.

П р и м е р 1. Получение моноклональных антител к ICAM-1,

Иммунизация. Мышей Balb/C подвергают иммунизации (внутрибрюшинно) 0,5 м 2 х 107 клеток JY в RPMI-среде 103 дня и 24

О

СА Я Ь

JJ

дня слияния. На 4-й и 3-й дни до слияния мышей подвергают иммунизации (внутри- брюшинно) 107 клеток U937, дифференцированных ацетатом форбол-12-миристата (далее ФМА), в 0,5 мл среды RPMI.

Дифференцировка клеток 937.

5 х 105/мл клеток U 937(ATCC CRL1593) подвергают дифференцировке инкубацией в среде RPMI, содержащей 10% эмбриональной бычьей сыворотки. 1 % глутамина, 50 мкг/мл гентамина и 2 нг/мл ФМА, в стерильных полипропиленовых контейнерах. На третий день инкубации половину объема среды отбирают и заменяют свежей полной средой, содержащей ФМА. На четвертый день клетки удаляют, промывают и подготавливают к иммунизации.

Слияние.

Клетки селезенки от иммунизованных мышей сливают с миеломными клетками РЗХбЗАд.8653 в соотношении 4;1. После слияния клетки переносят в плоскодонные микротитровальные пластины с 96 углублениями при концентрации 105 клеток селезенки/углубление.

Отбор анти-1САМ-1 положительных клеток.

Спустя неделю 50 мкл надосадочной жидкости подвергают скринингу следующим образом. Клеточные линии J Y и SRW-3 два раза промывают средой RPMI 1640, содержащей 5 мМ буфера Гепес, и повторно суспендируют до концентрации 2 х 10е клеток/мл. 50 мкл надосадочного моноклональ- ного антитела добавляют к 50 мкл полной среды RPMI, содержащей 200 нг/мл сложного эфира форбола, ФМА и 100 мкл клеток в концентрации 2 х 10 клеток/мл среды. При этом получают конечную концентрацию 50 нг/мл ФМА и 2 х 10 клеток на углубление. Клеткам дают осаждаться и определяют степень агрегации в различные моменты времени. Отбирают клетки из надосадочных жидкостей, инкубирующих агрегацию клеток JY, но не агрегацию клеток SKW-3, и клонируют дважды, используя метод ограниченного разведения. В результате этих экспериментов идентифицируют и клонируют три отдельных гибридомные линии, которые продуцируют моноклональные антитела анти-1САМ-1. Антитела, продуцируемые этими гибридомными линиями, обозначают IgGaa, IgGab и IgM, соответственно. Гибри- домная клеточная линия, которая продуцирует антитела IgGza, обозначают R6 5 D6 T9 B2. Антитело, продуцируемое предпочтительной гибридомной клеточной линией, обозначают P6 5 D6 E9 B2 (далее R6-5-D6). Гибридомная клеточная линия R6 5 D6 E9 B2 была депонирована 30 октября 1987 г, в

American Typeculture Collection и обозначена АТССНВ 9580.

Получение антитела осуществляют следующим образом, Мышей Balb/C внутрибрюшинно инокулируют 3-10 х 106 клеток. Несколько дней до инокуляции мышам внут- рибрюшинно дают либо неполный состав добавки Фройнда, либо пристан. Через несколько дней собирают образовавшуюся асцитную жидкость и антитело выделяют путем осаждения сульфатом аммония и аф- финой хроматографии на связанном с носителем протеине А.

П р и м е р 2. Влияние антитела анти5 ICAM-1 на пролиферацию человеческих периферических моноядерных клеток крови.

Человеческие периферические моноядерные клетки крови индуцируют для про0 лиферации с помощью присутствия и распознавания антигенов или митогенов. Некоторые молекулы, такие как митоген, конканавалин А или связывающие Т-клетки антитело ОКТЗ, вызывают неспецифиче5 скую пролиферацию периферических моноядерных клеток крови. Человеческие периферические моноядерные клетки крови являются гетерогенными в том, что они состоят из субпопуляций клеток, которые

0 способы распознавать специфические антигены. Когда периферическая моноядерная клетка крови, которая способна распознавать конкретный специфический антиген, встречается с антигеном, возникает, проли5 ферация такой субпопуляции моноядерных клеток. Токсин столбняка и гемоцианин блюдечка являются примерами антигенов, которые распознаются субпопуляциями периферических моноядерных клеток, но не

0 распознаются всеми периферическими моноядерными клетками у сенсибилирован- ных индивидуумов.

Исследуют способность моноклональ- ного тела R6-5-16 анти-1САМ-1 к ингибиро5 ванию пролиферации человеческих периферических моноядерных клеток крови в системах, для которых требуется межкло- нальная адгезия.

После очистки периферические моно0 ядерные клетки крови промывают три раза средой RPMI 1640 и культивируют в плоскодонных микронитровальных пластинках с 96 углублениями при концентрации 10 кле- ток-мл в среде RPM11640, дополненной 10%

5 эмбриональной бычьей сыворотки, 2 мМ глютамина и 50 мкг/мл гептамицина.

Антиген, либо Т-клеточный митоген, конканавалин А (0,25 мкг/мл), связывающее Т-клетки антитело ОКТЗ (0,001 мкг/мл); гемоцианин блюдечка, (10 г/мл) либо тетанусного анатоксина (в виде 1 :100 разбавления) добавляют к клеткам, которые культивируют, как описано выше, в присутствии в отсутствии антитела R6-5-16 (конечная концентрация 5 г/мл). Клетки культивируют 3,5 дня (эксперимент с конканавалином А), 2,5 дня (эксперимент с ОКТЗ) или 5,5 дней (эксперименты с гемоцианином блюдечка и тетанусным токсидным антигеном).

18ч до окончания эксперимента к культурам прибавляют 2,5 мкС; 3Н-тимидина. Определяют клеточную пролиферацию путем измерения включения периферическими моноядерными клетками крови тимидина в ДНК. Собирают включенный ти- мидин и подсчитывают с помощью жидкостного сцинтилляцией ного счетчика.

Было обнаружено, что антитело анти- ICAM-1 ингибирует в моноядерных клетках

пролиферативные ответы к митогену неспецифических Т-клеток, конканавалину А, антигену неспецифических Т-клеток, ОКТ-3, и специфическим антигенам, гемоцианину

блюдечка и тетанусному токсоидному антигену. Ингибирование антиадгезионным антителом сравнимо с ингибированием антителом анти-LFA-l. Поэтому можно предполагать, что ICAM-1 является функциональным лигандом LFA-1 и что антагонизм ICAM-1 будет ингибировать ответы специфических защитных систем.

Формулаизобретения

Штамм гибридомы АТССНВ 9580 (коллекция American Typeculture Collection Rochvill MB 20852 US А)-продуцент антител против гликопротеина.

Изобретение относится к иммунологии и может быть использовано для получения моноклонального антитела производного анти-гликопротеина. Цель изобретения создание шта Sptwe i АТССНВ 9580 Способ заключается том. что мыше подвергают двукратно мниуниаации клетками JV среде RP.MI с последующе иммуииаацие дифференцированными миристат-ацетатом форболв метками U 937 а той же среде, клетки селеэеики иммунизированных ммше отбирает и сливают с миеломиыми клетками РЭХбЗАц. 8853 с последующе инкубе цне слившихся клеток в присутствии сложного афнра миристата форболв и клеток JX или SKW-3, надосадоч- ную жидкость, иигибирующую агрегацию клеток JX. подвергают двукратному клоии- роеанию с использованием метода ограни- ченного рваеедения с последующе культивацие клонированных клеток а подходяще среде и выделением конечного продукта. Ё