Способ консервирования эмбрионов млекопитающих Советский патент 1993 года по МПК A01N1/02 

Изобретение относится к криобиологии и может быть использовано в экспериментальнойрепродуктологии. -...

Целью изобретения является удлинение: сроков хранения эмбрионов.

Поставленная цель достигается тем, что среде консервирования вместо химического протектора моноэтилового эфира глицерина используют биологический - низкомолекулярную (1-10 кД) фракцию .эпителия тонкого кишечника зимоспящего суслика в концентрации 0,12-0,20rp/л среды.

Выделение фракции производили по известной методике (3): на первом этапе ацетоновыйгомогенат ткани центрифугировали в течение 30 мин при ЗОООд, осадок лиофилизировали в IM уксусной кислоте и центрифугировали 1 час при 4000д. Полученный центрифугат подвергали последовательно ультрафильтрации через фильтры Халипор-4 (Эстония) и UM-2 (Am Icon-US А). Получали фракцию молекулярной массы 1-10 кО. После ультрафильтрации материал лиофилизировали и хранили в герметичных ампулах при -20°С.

П р и м е р 1. Эмбрионы мышей на стадии морулы вымывали при комнатной температуре средой Дюьльбекко (4), содержащей 10%-ную эмбриональную сыворотку коров. На этой же среде готовили фракцию эпителия тонкого кишечника (ФЭ) зимоспящего суслика с добавлением эмбриональной сыворотки.

40 эмбрионов разделили на две группы по 20 эмбрионов в каждой. Эмбрионы каждой группы помещали в стеклянную ампулу, содержащую 0,5 мл среды Дюльбекко и 10% .эмбриональной сыворотки. Ампулы с эмбрионами первой опытной группы охлаждали ступенчато от комнатной (+20°С) температуры +5°С, понижая температуру на 5°, и выдерживали при данной температуре в течение 5 мин. Аналогично охлаждэпи 0,5 мл фракции (1-10 кО), выделенной из эпителия тонкого кишечника зимоспящего суслика.

рН ФЭ был в пределах рН среды Дюльбекко с добавкой 10%-ной эмбриональной

00

to

00

сыворотки. ФЗ капельно добавляли в соотношении 1:1 к охлажденным эмбрионам. Конечная концентрация ФЭ составляла 0,12 г/л, После герметизации ампулы хранили при 5°С в течение 24, 48 и 72 часов. К эмбрионам второй, контрольной группы добавляли при комнатной температуре среду Дюльбекко, содержащую 10%-ную эмбриональную сыворотку, ступенчато охлаждали от комнатной температуры до 5°С, понижая температуру на 5°С и выдерживая при ней в течение 5 мин. После этого охлажденные эмбрионы ступенчато отогревали на водяной бане, повышая температуру на 5° каж- . дые 5 мин, Затем эмбрионы при комнатной температуре переносили в культуральную среду Виттена, где культивировали в течение 24 часов до выхода в бластоцисту (5). Сохранность эмбрионов контрольной группы составила 97,8%.

Эмбрионы опытной группы после хранения в герметически закрытых ампулах ступенчато отогревали в водяной бане, повышая температуру на 5° и выдерживая при каждой по 5 мин. Ампулы вскрывали стерильно и отмывали от ФЭ трехступенчато, добавляя к одной капле исходного раствора 10 капель среды Дюльбекко с эмбриональной сывороткой через каждые 3 мин. После этого эмбрионы опытной группы выдерживали 10 мин в культуральной среде и проводили культивирование в среде Виттена в атмосфере тройного газа (5% С02,90% № и 5% 02)при37°С в течение 24 часов до выхода в бластоцисту. Эмбрионы опытной группы развивались подобно контрольной. В табл.1 представлена сохранность эмбрионов после различных сроков хранения, результаты в сравнении с прототипом.

Из табл.1 следует, что заявляемый способ позволяет хранить эмбрионы на 1 сутки дольше без снижения их сохранности.

Л р и м е р 2. Способ осуществляли аналогично примеру 1. за исключением то- то, что среда хранения содержала различные концентрации ФЭ. Во всех случаях сохранность эмбрионов определяли по их развитию л культуре до стадии бластоцисты. Результаты представлены в табл.2.

Из табл. 2 видно, что наилучшие результаты достигаются при использовании ФЭ в концентрации 0,12-0,20 г/л среды.

ПримерЗ. Способ осуществляли аналогично примеру 1, за исключением того, что среда хранения содержали ФЭ «.различной молекулярной массой. Результаты представлены в табл.3.

Из табл.3 видно что высокую сохранность эмбрионов обеспечивает ФЭ молекулярной массы 1-10 кО.

П р и м е р 4. Способ осуществляли аналогично примеру 1, за исключением того, что в среде хранения использовали ФЭ сусликов Cltellus undulatus не в период спячки, а в период бодрствования. Результаты представлены в табл.4.

Из табл.4 видно, что при использовании вереде ФЭ, полученной у сусликов в период бодрствования, сохранность резко снижао ется.

П р и м е р 5. Изучали влияние ФЭ молекулярной массы 1-10 кО на угнетение биосинтеза белка при гипотермической хранении и степень его последующего восста- 5 новления.

Первую группу, содержащую 10 эмбрионов, после вымывания помещали в среду Дюльбекко с содержанием 10%-ной эмбриональной сыворотки и проводили изотоп- 0 ный анализ. Эта группа была контрольной. Вторая группа, содержащая также 10 эмбрионов в среде Дюльбекко с эмбриональной сывороткой была контрольной по отношению к эмбрионам, хранившимся 24, 48 и 72 5 ч в среде, содержащей ФЭ.

Стеклянные ампулы заполняли 0,5 мл среды Дюльбекко с 10%-ной эмбриональной сывороткой, после чего вносили эмбрионы.

0 Ампулы с эмбрионами ступенчато охлаждали от комнатной температуры (+20РС) до +5°С с выдержкой при данной температуре в течение 5 мин. Охлаждение 0,5 мл Ф-Э проводили аналогично. При +5°С в ампулу с 5 эмбрионами капельно в соотношении 1:1 добавляли 0,25 мг/л ФЭ. После отогрева на водяной бане и удаления ФЭ осуществляли . изотопный анализ сразу и после дополнительного культивирования в среде Виттена 0 при 37 °С в атмосфере тройного газа (5% СО2, 5% Оа, 90% Na). Проведение анализа . осуществляли следующим образом. Эмбрионы (10 шт) помещали в 0,5 мл среды BSM (5), содержащей ЗН-лейцин (в дозе 10 мккИ, 5 радиоактивность 1 мКи. ЧССР) и инкубиро- вали при 37°С в течение 3 часов. Затем промывали холодной средой, содержащей лейцин. Разрушали эмбрионы путем 10- кратного их замораживания и оттаивания. 0 Осаждение белков осуществляли при +4°С путем добавления 2 мл холодного ТХУ и последующего помещения на лед на 15 мин. Белки, осажденные на фильтрах, промывали 5 мл холодного 70%-ного спирта. Для 5 окончательного высушивания фильтров их выдерживали 10 мин при 50°С. Активность биосинтеза определяли с помощью счетчика, помещая фильтр в 14 мл жидкого сцин- тиллятора. В табл.5 приведены результаты опытов.

Результаты, приведенные в табл. 5, свидетельствуют о полном восстановлении биосинтеза белка эмбрионов в культуре после гипотермического хранения в течение 24.48 и 72 часов.

Заявляемый способ консервирования позволяет хранить эмбрионы млекопитающих в течение 72 часов в среде, не содержащей химических агентов, что исключает генетическое изменение эмбрионов в процессе их развития.

Ф о р м у л а и з о б р е те н и я Способ консервирования эмбрионов млекопитающих, включающий экспозицию их при 5°С в среде Дюльбекко содержащей

эмбриональную сыворотку плодов коров и протектор, о т л ичающийся тем, что, с целью удлинения сроков хранения эмбрионов, в качестве протектора используют фракцию эпителия тонкого кишечника зимоспящего суслика мол.мас. 1-10 кД в концентрации 0.12-0,20 г/л среды.

Таблица

Изобретение относится к криобиологии. Цель изобретения - удлинение сроков хранения эмбрионов. Эмбрионы помещают в среду Дьюльбекко, содержащую 10%-ную сыворотку плодов коров и охлаждают до 5°С. Затем добавляют охлажденную до 5° фракцию эпителия тонкого кишечника зи- моспящего суслика молекулярной массы 1- 10 кД до концентрации 0,12-0,20 г/л среды и хранят при 5°С трое суток. 5 табл.

Таблица 2

Таблица 3

Время хранения, ч

24

48

72

Условия эксперимента

Нативные эмбрионы

Сразу после хранения: 24 часа

4-8 часов 72 часа

После часового дополнительного культивро- вания:24 часа

4-8 часов

72 часа

Таблица 4

Сохранность эмбрионов, %

45,4 ±2,7 40,7 ±1,4 27,5 ±1,7

Таблица 5

Активность биосинтеза, имп/мин

1163 ± 35 нет включения нет вклинения нет включения

1.150 ± 20 1125 ±38 1110 ±47