Способ получения средства для диагностики группы крови Советский патент 1993 года по МПК G01N33/86 

Изобретение относится к способам получения средства для быстрой диагностики группы крови.

Цель изобретения - повышение стабильности средства..

Получаемое по предлагаемому способу средство для быстрой диагностики группы крови содержит анти-А, анти-В, анти-АВ и факультативно анти-D, анти-С и анти-Е реагенты, которые зафиксированы в полостях, образованных на поверхностно обработанном листе алюминия. Способ получения средства для быстрой диагностики состоит в том, что помещают реагенты анти-А, анти- В. анти-АВ и факультативно анти-В, анти-С и анти-Е в полости поверхностно обработанного алюминиевого листа и фиксируют реагенты на алюминиевом листе двухэтап- ной вакуумной сушкой.

В качестве носителя средства для быстрой диагностики в соответствии с изобретением используется алюминиевый лист толщиной 0,25-0,5 мм, В листе прессованием формуются полости диаметром 10-30 мм

и глубиной 0,3-0,6 мм. Число формуемых полостей зависит от требуемого количества реагентов, которые необходимо поместить на носитель; требуется еще одна дополнительная полость для контрольной пробы. Лист носителя, вы л рассованный и обрезанный до соответствующих размеров, подвергается поверхностной обработке в ванне двуокиси калия с последующим обильным прополаскиванием теплой и холодной водой и затем спиртом.

Для получения средства для быстрой диагностики в соответствии с изобретением используются реагенты анти-А, анти-В, и анти-АВ, принадлежащие к главным группам крови, а также реагенты анти-D, анти-С, анти-Е и т.д.. принадлежащие к резус-системе.

Реагенты, принадлежащие к главным группам крови, приготовляются таким образом, что сыворотка или плазма, очищенная от фибриногена соответственно крови, принадлежащей к группам крови А (анти-В), (ан- ти-А) и О (анти-АВ), имеющим очень высокую способность поглощать кислород (начинаюсо

со

о

ь 00

Сл

щим агглютинацию через 2-5 с и создающим 4-перекрестную агглютинацию в течение 3 мин), смешиваются в соответствии с группами крови в асептических условиях, инактивируются термообработкой, фиксируются, адъювируются и фильтруются в стерильное состояние.

Инактивация осуществляется тепловой обработкой, длящейся в течение примерно 30 мин при 50-60°С. Прошедшие тепловую обработку реагенты могут фиксироваться, например, азидом натрия. Может быть добавлен в качестве адъювирующего агента лиофилизирующий добавочный (вспомогательный) материал, например сахароза, в количестве около 3%.

Реагенты, принадлежащие к резус-системе, приготовляются соответственно из сыворотки или плазмы крови анти-В, анти-С, анти-Е и т.д. аналогично:реагентам, принадлежащим к главным группам крови; однако к реагентам добавляются также адъювирую- щие агенты, способствующие агглютинации, например фиколль, глицин и метилцеллюло- за.. .На приготовленные листы в асептических условиях наносятся капли, содержащие по 0,03-0,05 мл реагентов. Помимо реагентов, принадлежащих резус-системе, добавляются также капли по 0,03-0,05 мл 1 %-ного раствора папаина, активированного цистином и цистеином для определения ферментным методом, затем реагенты высушиваются на носителе двухэтапной вакуумной сушкой. Эта сушка осуществляется в лиофилизирующем оборудовании (машина) или в установке вакуумной сушки. Первый этап сушки осуществляется при давлении 100-300 Мм рт.ст,, предпочтительно при давлении 200 мм рт.ст., и при температуре 15-25°С, предпочтительно при 20°С; второй этап сушки осуществляется при давлении 0,05-0,5 мм рт.ст., предпочтительно при давлении 0,1-0,05 мм рт.ст., и при температуре , предпочтительно при 40°С, Весь период сушки длится примерно 3-5 ч.

При использовании реагенты растворяются одной каплей водопроводной воды (кахкдый из них), а капля контрольного образца помещается в предназначенную для него полость. Определение группы крови может осуществляться с использованием образцов крови, взятых непосредственно из пальцевой подушечки и получающихся из коагулированной крови или из крови, содержащей препятствующий коагуляции агент. Контрольный образец приводится в контакт с реагентами при помощи соответствующего приспособления, например, путем смешивания с полистироловыми гранулами

вместе с диагностикой. Лист затем несколько раз наклоняется, а затем помещается на горизонтальную поверхность и оценивается спустя 3 мин.

Преимущества средства для быстрой

диагностики в соответствии с изобретением состоят в следующем. В сравнении с известным способом средство более стабильно (срок годности - минимум 3 года, по прототипу - 2 года максимально). Носителем является поверхностно обработанный алюминиевый лист, делающий обильной любую пропитку, специальное покрытие или изолирующий слой. Нанесение реаген5 топ и определение группы крови облегчаются благодаря выполненными в листе полостям. Адгезия (прилипание) реагентов к поверхности алюминиевого листа стабильна; при использовании реагенты раствори0 мы врдопроводной водой и растворение - происходит немедленно... Реакция очень хорошо заметна на алюминиевом листе. Средство быстрой диагностики в соответствии с изобретением содержит также реагент ан5 ти-АВ, поэтому возможности ошибок уменьшены и определение группы крови может осуществляться безошибочно. Определе- , ние группы крови, реализуемое таким образом, эквивалентно определению группы

0 крови, осуществляемому в лабораторных условиях. Вследствие этого теплопроводность алюминиевого листа, содержание воды в реагентах могут быть сведены к минимуму сушкой в вакууме, поэтому диагностическое

5 средство может храниться даже при комнатной температуре без изменений его качества в течение сравнительно длительного времени (от 2 до 5 дет),

Пример, Получение реагентов, при0 надлежащих к основным группам крови.

Сыворотки крови с титром не менее 1,64 анти-А, анти-В или не менее 1:32 анти-АВ соответственно, имеющие хорошую способность поглощения кислорода {начинает

5 свертывание через 2-5 с и создает 4-перекрестную агглютинацию через 3 мин), смешивают в соответствии.с каждой из групп крови в асептических условиях, фиксируют добавлением 0,1% азида натрия и после до0 баоления 3% сахарозы инактивируюттепло- вой обработкой при 56°С в течение 30 мин, а затем фильтруют через очищенный и стерилизующий фильтр.

Плазмы крови с титром не менее 1:128

5 анти-А, анти-В или не менее 1:64 анти-АВ соответственно, имеющие хорошую способность поглощения кислорода, смешиваются в соответствии с каждой из групп крови в антисептических условиях, фиксируются добавлением 0,1 % азида натрия и освобождаются от фибриногена добавлением левули- ната кальция или дигидрата хлорида кальция, затем обрабатываются так же, как и сыворотки.

Получение реагентов. принадлежаа1их резус-системе.

Сыворотки крови с титром не менее 1:128 анти-D, анти-С, анти-Е и т.д. фиксируют добавлением 0,1 % азида натрия, смешивают соответственно с каждой из групп крови в антисептических условиях и инакти- вируют при 56°С в течение 60 мин. Затем нерегулярные агглютинины удаляют абсорбцией, добавляютЗ% сахарозы, 2% глицина и, для ускорения свертывания, 0,3-0,5% фи- колла, а также 0,01-0.02% метилцеллюлозы и фильтруют в стерильное состояние.

Плазмы фиксируют аналогичным образом добавлением 0,1 % азида натрия, освобождают их от фибриногенов добавлением дигидрата хлорида кальция или тромбина, а затем обрабатывают так же, как и сыворотки.

Способность к поглощению кислорода у реагента удовлетворительная, когда реакция начинается в пределах 1 мин. и увели- чийается до максимальной в пределах 3 мин.

Для определения неполной гемагглюти- НИ.ННОСТИ требуется также растворе 1% па- паина, который приготовляют при помощи фосфатного буфера 1 (15 моль) л, активированного добавлением гидрохлорида 1-цис- тина и 1-цистеина, и который содержит 0,0125% метилцеллюлозы. . Получение носителя.

При использовании анти-А, анти-В, ан- ти-АВ и анти-D формуется пять полостей прессованием на. алюминиевом листе толщиной 0,25-0,5 мм. Глубина этих полостей составляет 0.3-0,6 мм. Четыре полости имеют диаметр 15 мм, а пятая полость должна быть больше и имеет диаметр, например, 30 мм. После прессования и вырезания листы выдерживаются в 20%-ном растворе гидроокиси калия при 90°С в течение 3 мин. а затем обильно споласкиваются теплой и холодной водой и затем спиртом.

Получение диагностического средства.

0,03 мл реагентов анти-А, анти-В и ан- ти-АВ каплями помещают в три малых полости приготовленного и поверхностно обработанного листа. Четвертую малую полость оставляют пустой для образца крови. В большую полость капают 0.3 мл реагента анти-В. а немного позже 0.05 мл активного раствора пзпаина. Реагент, принадлежащий к резус-системе, может быть также нанесен на другой лист.

После этого листы помещают в лиофи- лизирующую установку и начинают двух- этапную вакуумную сушку. На первом этапе вакуум неглубок (около 200 мм рт.ст.) и температура низка (20РС), на втором этапе вакуум глубок (0,1-0,05 мм рт.ст.) и температура вы- ше(40°С).

Дополнительные примеры на средние и граничные значения даны в таблице.

При использовании этого способа вещество высушивают при сравнительно низкой температуре даже без замораживания, поэтому можно избежать изменений структуры белка и, как следствие, снижения активности из-за замораживания.

Приготовленное таким образом диагностическое средство упаковывают вместе с полистироловыми гранулами в мешочки из алюминиевой фольги и герметично закрывают.

Определение групп крови осуществляют при комнатной температуре. На алюминиевой пластине находятся четыре углубления (выемки), из которых первые три

содержат реактивы (анти-АВ, анти-В, анти- А. тест-сыворотки), в четвертое капают каплю определяемой крови.

Тест-сыворотки растворяют, используя по капле (примерно 30 мкл) водопроводной

воды. Тест-сыворотки растворяются в несколько секунд.

Каплю определяемой кроеи (свернутой или лишенной возможности свертываться) помещают в четвертое углубление. Определение также можно осуществлять с помощью получаемой из кончика пальца крови, когда кровь прямо из кончика пальца капает в углубление. Определяемую кровь с помощью палочек, которые упакованы наряду с пластиной, тотчас переносят далее, конец палочки окунают в кровь и прилипшую к палочке кровь хорошо смешивают с тест-. сывороткой. Другой конец палочки используют для смешения крови со второй

тест-сывороткой. Таким образом, достаточно двух палочек для смещения крови с тремя тест-сыворотками.

Пластину в течение Нескольких секунд неоднократно покачивают, затем ставят на

ровное место. Спустя 3 мин пластину покачивают туда и обратно под углом примерно 30° и результаты считывают невооруженным глазом.

Форму л а изобретения

Способ получения средства для диагностики группы крови путем нанесения на носитель реагентов анти-А, анти-В и анти-D. отличающийся тем, что, с целью повышения стабильности средства, дополнительно используют в качестве реагентов антисыворотки антигАВ, анти-С и антиг-Е, в качестве носителя - алюминиевый лист, антисыворотки перед закреплением на носителе обрабатывают азидом натрия, полученный реагент каждой антисыворбтки

помещают по одной капле в полости алюминиевого листа и закрепляют сушкой в вакууме, которую проводят в два этапа, причем на первом этапе при 15-25°С и 100-300 мм рт.ст., а на втором - при 30-50°С и 0,05-0,5 мм рт;ст.

Использование: медицина, диагностика. Цель: повышение стабильности средства. Сущность изобретения: диагностическое . средство состоит из реагентов а нти-А, анти-В, анти-АВ и, факультативно, анти-D, анти-С и анти-Е, которые фиксированы в полостях, образованных на поверхностно обработанном алюминиевом листе. Средство получают помещением капель указанных реагентов в полости поверхностно обработанного алюминиевого листа и фиксацией их на листе вакуумной сушкой в два этапа. 1 табл,