ИММУНОЛОГИЧЕСКИЙ РЕАГЕНТ НА ОСНОВЕ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ ЧЕЛОВЕКА КЛАССА M (IGM), ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ЭКСПРЕСС-ОПРЕДЕЛЕНИЯ РЕЗУСНОГО АНТИГЕНА D В КРОВИ ЧЕЛОВЕКА Российский патент 1997 года по МПК G01N33/53 C12P21/08 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в медицине для определения резус-принадлежности крови человека экспресс-методом в прямой реакции агглютинации на плоскости или в пробирочном тесте. В основе препарата лежат моноклональные человеческие антитела класса IgM, продуцируемые бессмертной гетерогибридомой. Антитела вызывают агглютинацию нативных эритроцитов, несущих антиген D системы резус. Авидность антител в реакции агглютинации на плоскости предлагается усиливать созданием среды с низкой ионной силой. Реагент выпускается под названием Поликлон анти-D Супер.

В настоящее время для определения резус-принадлежности крови в реакции агглютинации на плоскости используется отечественный реагент на основе поликлональной иммунной сыворотки, содержащей неполные анти-D антитела, смешанной с полиглюкином (Нижегородская СПК). Полиглюкин не стандартный препарат, большинство партий обладает способностью агглютинировать эритроциты. За счет этого препарат на основе полиглюкина дает большое число ложно-положительных результатов. Отечественных моноклональных анти-D антител класса IgM нет.

За рубежом получены клеточные линии, продуцирующие моноклональные анти-D антитела класса IgM (Thompson, 1986). Фирмой "Ortho" (Германия) выпускается анти-D препарат, содержащий моноклональные IgM анти-D антитела в смеси с поликлональными неполными антителами. В отличие от предлагаемого в заявке реагента препарат фирмы "Ortho" предназначен для проведения только пробирочного теста. К тому же, сравнительное тестирование этим методом образцов со слабым антигеном Du показало более высокую чувствительность предлагаемого препарата (см. таблицу).

В настоящее время предлагаемый реагент не имеет аналогов среди реагентов для резус-типирования в прямых реакциях агглютинации ни по высокой чувствительности, ни по простоте проведения анализа, который занимает 3 мин. Крупномасштабное культивирование линии-продуцента антител позволяет нарабатывать практически не ограниченное количество антител, что актуально в связи с сокращением заготовок иммунных сывороток.

1. Получение бессмертной гетерогибридомной линии, секретирующей моноклональные анти-D антитела
а) Мононуклеары резус-отрицательного донора, иммунного против D-антигена системы резус, трансформировали вирусом Эпштейна-Барр. В качестве источника вируса была использована линия В-95.8. После обработки вирусом клетки высаживали в 96-ячеечные платы по 30000 на ячейку в присутствии Циклоспорина А 0,75 мкг/мл.

б) Через 3 недели были проведены селекция линий, секретирующих полные анти-D антитела, и их клонирование на фидере из облученных гомотипических клеток (мононуклеары или клетки лимфобластоидной линии, не секретирующей антитела).

в) Клонированные линии наращивали и сливали с миеломой мыши РЗ-Х63-Ag. 8.653 в присутствии полиэтиленгликоля м.в. 3000-3700. Селекцию гибридов проводили в среде с НАТ и уабаином.

г) Гетерогибридомы, секретирующие IgM анти-D антитела, клонировали методом лимитирующих разведений на макрофагах мыши. Линия НМ-92 была получена в результате 5 последовательных клонирований со 100%-ным выходом антителопродуцирующих гибридов в двух последних. Линия непрерывно культивировалась в течение 15 мес. без снижения титра антител в культуральной среде. Штамм хранится в коллекции перевиваемых клеточных культур под N 632D и имеет следующие признаки.

Культуральные признаки. Суспензионная культура в жидкой среде, пассирование (1: 3)-(1:4) через 3-4 суток. Среда для культивирования: RPMI 1640, 10% свиной сыворотки, 2% эмбриональной телячьей сыворотки. 20 мМ НЕРЕS-буфера, 4 мМ L-глутамина, 2 мМ пирувата натрия. 5 х 10^-5 2-меркаптоэтанола, антибиотики. Оптимальной системой для культивирования является роллерная установка типа Вellco.

Криоконсервирование клеток. Клетки суспендируют в полной питательной среде и добавляют равный объем эмбриональной сыворотки с 20% диметилсульфоксида. Клетки в криоампулах помещают в холодильник с -70^oC, через сутки переносят в жидкий азот.

Цитогенетические признаки. Число хромосом 96 (37%), 6-8 хромосом человека.

Сведения о контаминации линии. Контаминации бактериями, грибами, микоплазмами, вирусами гепатита В, СПИДа, Эпштейна-Барр не обнаружено, другие вирусы не тестированы.

Характеристика моноклональных антител, продуцируемых штаммом. Антитела специфично выявляют D-антиген системы резус, не дают перекрестных реакций с другими эритроцитарныи антигенами. Титр антител в культуральной жидкости составляет (1:1024)-(1:4096) в реакции прямой агглютинации в микроплате.

2. Разработка препарата на определения резус-принадлежности в реакции агглютинации на плоскости
Культуральный супернатант может быть использован как реагент для определения резус-фактора в пробирочном тесте. Супернатант также вызывает агглютинацию резус-положительных эритроцитов в реакции на плоскости, однако время появления агглютинации около 30 с, четкие агглютинаты образуются через минуту после смешивания супернатанта с исследуемыми эритроцитами. Использование усилителей, повышающих авидность моноклональных антител в реакции агглютинации на плоскости (альбумин 1,8% раствор NaCl, этилендиаминтетрауксусная кислота ЭДТА), не привело к сокращению времени появления агглютинации и укрупнению агглютинатов. Для усиления реакции на плоскости был применен раствор с низкой ионной силой следующего состава: 7% глюкозы, 0,2% NaCl в дистиллированной воде. Растворы с низкой ионной силой используются в серологической практике для усиления реакции сенсибилизированных неполными антителами эритроцитов, с антиглобулиновой кроличьей сывороткой при проведении пробы Кумбса (ссылка 2). Информации об использовании растворов с низкой ионной силой для разведения моноклональных антител нет. Оптимальными являются следующие соотношения культурального супернатанта с раствором: на 1 объем супернатанта 2-7 объемов раствора с низкой ионной силой. Соотношение подбирается так, чтобы обратный титр антител в разведенном реагенте в реакции прямой агглютинации в микроплате составлял не менее 1:512. При этом время наступления агглютинации при проведении теста на плоскости снижается до 1-6 с, крупные агглютинаты формируются за 10-15 с. В качестве консерванта используется 0,1% -ный азид натрия, добавление которого лишь незначительно повышает ионную силу раствора и не влияет на качество реагента.

3. Пример приготовления серии анти-D реагента объемом 10 литров
1. Размораживаем ампулу с 10^в криоконсервированных клеток гетерогибридомы НМ-92 и культивированием в роллерном флаконе в объеме 300-350 мл в полной питательной среде (см. выше).

2. Через 3-4 суток считаем клетки и рассаживаем до плотности 0,35 х 10⁸/мл. Через 2-3 пассажа объем культуры составляет 2,5-3 литра.

3. Титруем супернатант в микроплате с D-положительными эритроцитами и подбираем, как указано выше, соотношение с раствором с низкой ионной силой. К примеру, титр антител 1:2048. Соотношение должно быть следующим: 2,5 л супернатанта и 7,5 л раствора.

4. Готовим раствор с низкой ионной силой по указанной в разделе 2 прописи.

5. Смешиваем супернатант с раствором. При необходимости фильтруем для дополнительной стерилизации через мембранные фильтры с диаметром пор 0,22-0,45 мкм.

6. Стерильно разливаем в ампулы или флаконы.

Источники информации
1. Thompson K.M. Melamed M.D. Eagle K. et al. //Immunology, 1986, V. 58, p. 157-160.

2. Technical Manual of the American Association of Blood Banks. Washington, 1981, p. 397.

Использование: в биотехнологии, для определения резус-принадлежности крови человека экспресс-методом. Сущность: получение препарата на основе моноклональных антител класса М, с помощью которого можно выявлять антиген D системы резус в крови человека. Антитела продуцируются гетерогибридомой НМ-92, супернатант гибридомы смешивают с раствором, обладающим низкой ионной силой, и получают указанный диагностический препарат. 1 табл.

1 Иммунологический реагент на основе моноклональных иммуноглобулинов человека класса M (IgM), используемый для экспресс-определения резусного антигена D в крови человека и представляющий собой смесь супернатанта гетерогибридомы НМ-92, продуцирующей указанные IgM, и раствора с низкой ионной силой в соотношении 1 объем супернатанта на 2 7 объемов раствора с низкой ионной силой.