Штамм вируса BacULoVIRUS РоLYнеDRоSIS LохоSтеGе SтIстIсаLIS L. для получения препарата против лугового мотылька Советский патент 1993 года по МПК A01N63/00 C12N7/00 

Погибших насекомых микроскопируют для установления причины гибели,

Для выделения ВЯП лугового мотылька к трупам гусениц насекомых, погибших от полиэдроза добавляют водопроводную воду в соотношении 1:2 и помещают в термостат при температуре 30°С на 6-7 дней. За это время происходит активное бактериальное разложение остатков тканей насекомого и освобождение полиэдров. После этого трупы гусениц тщательно измельчают в гомогенизаторе, разводят в 2 раза водой и фильтруют через 4 слоя марли. Полученный фильтрат центрифугируют 4-5 раз при 3000 об/мин 20 мин для очистки вирусных включений от тканевого детрита. Полученный осадок состоит из полиэдров. Экспериментальный штамм ВЯП лугового мотылька хранится в форме леофилизирован ;ого порошка в запаянных ампулах у авторов и в коллекции депонированных вирусных штаммов Всесоюзного научно-исследовательского института защиты растений под Ыг 12.

Предложенный штамм энтомопатоген- ного вируса имеет следующие морфологические и физико-биохимические признаки. Белковые включения (полиэдры) вируса в основном треугольной формы. Размер полиэдров 1,2 ±0,18-2,1 ±0,23 мк. Внутри полиэдров содержится до 360 виринов палочковидной формы размеров 246 ± 14x51 ±3 нм. Молекулярная масса ДНК 70.106 дальтонов.

Вирус ядерного полиэдроза лугового мотылька размножается на живых насекомых (гусеницы лугового мотылька) в условиях, подходящих для развития насекомого-хозяина.

Экспериментальный штамм ВЯП лугового мотылька активен против гусениц лугового мотылька любого возраста при заражении суспензией полиэдров с титром 1,28.10° пол/мл и выше. Биологическая эффективность ВЯП от 50% (титр суспензии .1,28.1Q5 пол/мл) до 100% (титр суспензии 1,5.107 пол/мл).

Пример конкретного использования экспериментального штамма.

Штамм вируса ядерного полиэдроза используют для заражения от 1,10 до 1.10 пол/мл, добавляют в искусственный корм в количестве 0,3 мл на 1 г искусственной питательной среды (ИПС), которую скармливают гусеницам лугового мотылька 3 возраста. Гусениц содержат в чашках Петри по 15 штук в каждой чашке с 1 г ИПС. Для каждой концентрации вируса берут пять повторно- стей. После поедания зараженного корма

0

5

(через 24 часа) гусеницам лугового мотылька дают чистый корм (ИПС). Гусеницу считают погибшей от полиэдроза, если в ее тканях при микроскопировании обнаруживают полиэдры. Гибель насекомых фиксировали в течение 10 суток, Результаты опыта представлены в табл.1.

Далее определяют Л Kso по формуле: 1дЛК5о 1дСм- ет( 2 Li-0,5), где См - максимальная из испытанных концентраций

ff- логарифм кратности разведения суспе-нзии,

LI - гибель гусениц в долях смертности, вычисляемая по формуле

, . По Пк

11 -тг тьргде

20

П0 - количество мертвых гусениц в опыте

5

0

5

0

5

0

5

i - концентрация (сумма 5 повторно- стей) шт,

Пк - количество мертвых гусениц в контроле, шт.

N - количество тест-гусениц, испытанных в 5 повторностях (равно 75) шт,

В приведенном примере

1дЛ1 5о 1дЮ8-1д10(1+0,973+0,853+ +0,346+0,226-0,5)8-2,898

кдЛКзо Ш

,28.105пол/мл

Опыты показывают, что ВЯП лугового мотылька патогенен для гусениц лугового мотылька Л Кдо равна 1,28.10s пол/мл.

Определение энтомопатогенной активности ВЯП лугового мотылька проводят путем скармливания гусеницам 3 возраста ИПС с добавлением водной суспензии полиэдров лугового мотылька, содержащей от 1.10 до 1.108 пол/мл на корм помещают гусениц. Насекомых содержат по 15 в чашках Петри с ИПС. Через 24 часа гусеницам меняют корм и далее кормят чистым кормом. Учет погибших насекомых проводят ежесуточно в течение 15 суток. Погибших личинок микроскопируют для установления причины гибели.

Подсчет полиэдров в водной взвеси (титр вирусной суспензии) осуществляют в камере Горяева. .

Установлено, что при концентрации полиэдров в суспензии от 1,28.105 в мл и выше гибнет 50-100% гусениц лугового мотылька..

Для приготовления энтомопатогенного препарата на основе предложенного вируса готовят водную суспензию полиэдров, содержащую выше 1,28.10 пол/мл. Титр полиэдров в суспензии подсчитывают с

помощью камеры Горяева. Для получения мдссы полиэдров, гусениц лугового мотыльки заражают суспензией полиэдров с тит- рбм 1,28.10 пол/мл и выше в лабораторных условиях при температуре 26±2°С.

По данным смертности определяют величин ы Л КБО.

; Для природного штамма ВЯП лугового мотылька

1 1дЛК50(1д108-1дЮ)0,68+0,653 + +0,453+0,4+0,386-0,5)5,928

,85.106пол/мл.

Предложенный штамм активен против гусениц лугового мотылька любого возраста при пероральном заражении суспензией полиэдров с титром 1,28.10 пол/мл и выше. Биологическая эффективность от 50% до 100% достигается при титре вирусной суспензии 1,28.105 до 1.108 пол/мл. Формула изобретения Штамм вируса Baculovlrus Polyhedrosls Loxostege sticticalis L ВИЗР hfe 12 для получения препарата против лугового мотылька.

Таблица 1 ,

Результаты заражения гусениц лугового мотылька 3 возраста ВЯП лугового мотылька ( экспериментальный штамм)

Гибель гусениц лугового мотылька 3 возраста. 10 суток после заражения (по повторностям)

Таблица 2