Штамм перевиваемых клеток эмбрионов озимой совки АGRотIS SеGетUм SснIFF для культивирования энтомопатогенных вирусов Советский патент 1993 года по МПК C12N5/00 A01N63/00 

Изобретение относится к вирусологии, в частности к культивированию клеток и тканей с целью наработки и изучения энтомр- патогенных вирусов, и может быть использовано в сельском хозяйстве для получения энтомопатргенных препаратЬв.

Для наработки и изучения вирусных агентов обычно используют гусениц, соответствующих штамму вируса вида насекомых. Для этого гусениц MI-IV возраста

заражают вирусом через корм. Инфицированных насекомых содержат в лабораторных условиях в течение 5-10 сут до их гибели. Погибших гусениц собирают, гомогенизируют, получают вируссодержащий материал с остатками кутикулы и тканей насекомых, с гемолимфой, с ворсинками и, как правило, эндогенными микроорганизмами, Такая наработка вируса обладает рядом недостатков, связанных с нетехнологичностью процесса и его трудоемкостью. Получаемый вирусный материал неоднороден, содержит большое количество посторонних примесей, в том числе и микроорганизмов. Микроворсинки и остатки кутикулы являются аллергенами, что ограничивает использование полученной вирусной биомассы.

Любые биохимические, генетические и молекулярно-биологические исследования энтомовирусов в насекомых затруднены из- за неоднородности получаемого вирусного материала.

Альтернативным способом является технология наработки вирусной биомассы с использованием культур клеток насекомых.

Известны системы получения вирусов ядерного полиэдрона (ВЯП) на определенных линиях клеток. Это, например, использование культур клеток совки Spodoptere frugiperda для выращивания ВЯП Autographa californica; или применение линии клеток капустной совки Mamestra brassicae для получения биомассы ВЯП А. callforoica. При этом урожай вирусов может достигать 2 tO7 полиэдров на мл в монослое и (2-3) 106 пол/мл в суспензии. Преимущества этого способа.в том, что вирусный материал свободен от Остатков тканей, ворсинок, кутикулы насекомых; однороден и свободен от посторонних микро- организмов-контаминантов,

Озимая совка - значимый вредитель зерновых культур в СССР, однако в настоящее время не существует клеточных технологий наработки специфически действующего на этого вредителя вирусного препарата. Необходима разработка Или получение новых высокоэффективных вирусных агентов.;

Получение или выбор вирусного агента для озимой совки затруднено без системы Тщательного анализа вирусного материала и клрнирования, поскольку в насекомых продуцируется комплекс вирусов - вирус ядерного полиэдроза, вирус гранулеза и часто присоединяется вирус цитоплазматиче- ского полиэдроза. Подобные работы возможны только при работе In vitro. Однако в настоящее время в /wTepatype не описаны длительно культивируемые линии клеток озимой совки. Неизвестны также данные репродукции вирусов ядерного (ЙЯП) и цитоплазматического (ВЦП) полиэд- розов озимой совки в других линиях клеток.

Целью изобретения является получение стабильного штамма перевиваемых клеток озимой совки Agrotis segetum, свободного от контаминантоа, культирируемого на доступных средах, обеспечивающего репродукцию вирусов, поражающих гусениц озимой совки.

Поставленная цель достигается тем, что

получен новый штамм перевиваемых клеток из тканей эмбрионов озимой соки Agrotis segetum МБ-ОзС4-788. Штамм депонирован во Всесоюзной коллекции перевиваемых культур клеток насекомых Института

общей генетики им, Н.И.Вавилова АН СССР (г.. Москва) под номером ВСКК (Б) А-28.

Штамм перевиваемых клеток озимой соки МБ-ОэС4-788 получают трипсинизэ- цией и механическим дроблением 20-50 23-дневных эмбрионов озимой совки с соблюдением правил асептики. Отмывают клетки и кусочки тканей эмбрионов от оболочек яиц и трипсина в солевом растворе Грейса, содержащем пенициллин и стрептомицин в десятикратной концентрации (1000 ед./мл). После отмывай центрифугирования у осадок клеток и кусочков тканей ресуспен- дируют в свежей порции питательной среды Грейса с добавлением 100 ед. /мл канамицина- и 10% по объему сыворотки эмбрионов коров энергично пиПетируют. Подсчитывают количество жизнеспособных клеток, доводят их концентрацию до (4-5) 10клеток в 1 мл средой Грейса. содержащей 10% эмбриональной сыворотки коров и 100ед./мл канамицина. Суспензию клеток переносят в сосуд для культивирования. Миграцию и деление клетрк наблюдают через 1-1,5 мес после посева клеток. Смену среды осуществляют 1-2 раза в месяц не более чем на 30% от объема. После формирования 50-60% монослоя клетки сбивают механическим способом в свежей порции среды и переносят на новый культуральный сосуд. Первые5-10

пассажей пересевы осуществляют не чаще, чем 1 раз в 2-3 недели. Начиная с 10-15 пассажа пересев проводят 1 раз в неделю, Кратность раесева 1:3-1:5. посевная концентрация составляет (2-3) 105 «ся/мя.

Через Ю-15 пассажей клетки подвергают обследованию. Проводят контроль контаминации клеток с помощью методов - окраски флюорохромами и высевом на селективные среды, морфологический и кариологический внализ. электронно-микроскопическое исследова- ние/ :.. . - .

Морфологические свойства. В культуре клеток МБ-ОзС4-788 преобладают фибробластоподобные клетки средних размеров, встречаются круглые, гемоцитоподобные клетки. Ядро округлой формы. Ядрышки различной величины и формы 1-2 в ядре (фиг. 1).

Контроль контаминации. По данным Электронно-микроскопического анализа, изучения под люминесцентным микроскопом препаратов, окрашенных ДНК-флюо- рохромами; выделения на селективных средах - клетки свободны от вирусной, ми- «оплазменной, грибковой и бактериальной контаминации.

Карйояогическйе свойства. Распреде- йёииёЧисла хромосом определят подсчетам хромосом в 100 метафазных пластинках. На фиг. 2, 3 представлены микрофотографии метафазной пластинки и показана распределение числа хромосом в (слетках штамма МБ-ОзС4-Ш8 на 60 пасса-, же,/ Кариологическййi анализ показал, что клетки штамма }У1Б-ОзОг788 имеют набор Ш $0-220 мелких голоцентрйчёских хромо фоМ, характерных для клеток чешуекрылых %ас екомых - .;-;V ;.- :Г -. ; -,- . -- -у: у v Культуралшые свойства. Клетки штам- Навыращивают в моНОслоё при 28°Свсре- Грейс с добавлением 10% сыворотки эмврионов коров. Тип роста - смешанный, .йцб аций - (); Ю- кл/мя; механическим встряхиванием яи- |Ц йёТирЬйанием, пересевают через 5-7 сут:кулй1гивл рдвани;я. 1:--: :Ч--/ 4 . : : КрйЪконсервзция и хранение. Клетки Литамма МВ-ОзС4-788 хранятся в замороженном состоянии 6 жидком afsOTe при мй- jftyc Т9б°С, Режим замораживаний: снятые со етеклай свежей среде Грейса клетки цен- f рйфугйруют vt рёсуспёндйруют в новой порций ростовой среды, содержащей 16% эмбрйбнайьйбй сыворотки коров, доводя цёйггр цйЬ клеток до |5-fO} 10е клеток а I Мя; Затем медагенно при постоянном йе ё |Шй§анйй, добавляют рй&ный объем 0йежей роётойой среды, содержащей 10% в 5ро1Рк1И и 20% глицерина. Суспензию aaTHiaaiot rto ампулам и замораживают в |ме€й спирта и KHflKof о азота, понижая тем- пёрату Е сЬскд остью. 1° в минуту до температуры м нус4Ь°С с последующим погружением & хранилище бйопродуктов с кйДк шазотому -:;:;|. ;.-л- :, - -. ;-. ::. :- Васстайрвлёние культуры клеток осуществляют следующим образом: ампулу с i eTkaMw извлекают из жидкого азота и по- йещают ia воДяыукз баню с температурой (ЗоЯз5)рС, постоянно меняя положение ампулы, оттаивают. Ампулу с клетками (укрывают, соблюдая правила асептики, сусШййю размороженных клеток перёйо- ят в центрифужную пробирку. Порциями, Ьрстоянно перемешивая с интервалом в t-2 Мин, добавляют ростовую среду в количест- Se, составляющем 0,5; 0.5:1; 2; 3 мл. Суспензию центрифугируют, осадок ресуслендиру- ют в свежей ростовой среде, подсчитывают .общее количество клеток, долю жизнеспособных клеток, и разводят ростовой средой 5 до концентрации жизнеспособных клеток (2,5-3) 10 кл,/мл и помещают в культу- рэльный сосуд.

Вирусологические свойства, Полученный штамм перевиваемых клеток озимой «v

0 кипродуцирует вирус ядерного и цитоплазмаТическогр полйэдрозов озимой с0аки (Е(ЯПО|С4 и ВЦПОзС). Он продуцирует также и Другие вирусы, например вирус

.. ядерного полиздроза капустной совки

5 шта 4мовi ВЯГТКС-З и ВЯПКС-Ю Продуцируемые клетками вирусы по морфологическим признакам идентичным исходным вирусам, наработанным в гусеницах соот- вётЬТвующего вида насекомых.

0 Так как в литературе нет сведений о .продукции знТомЬпатогеннйх вирусов, поражающих совку Agrotis segetunri, в перевиваемых линиях клеток, то полученный штамм перевиваемых клеток озимой совки

5МБ-ОзС/5-Т 88 является единственным, продуцирующим ВЯПОзС и ВЦПОзС и, следо- вательно, обладает существенными

. ОТЛИЧИЯМИ.

На фиг. 1 изображенз и представлена

0 фотогр афия клеток культуры озимой совки Мб-ОзСг-788 (нефиксированные и неокрашенные клетки при увеличении х 400); на фиг. 2 изображена микрофотог фия мета- фаэной пластинки клеток штамма МБ5 рз.С4-788. окраска азур-эозином; на фиг. 3 изображена диаграмма распределения числа хромосом в клетках штамма МБ-ОзС4- 788 на 60 пассаже,

При мер 1. Получение первичной

0 культуры клеток из эмбрионов озимой совки Agrotls segetum и поддержайие полученно. го штамма.

Яйца озимой совки аккуратно снимают с подложки, отмывают стерильной дистил5 лйрованной водой, помещают а стерильный флакон из дрота. Стерилизуют в течение 7-10 мин 0.5%-ным растэором йода в 70° этиловом спирте. Отмывают от стерилизующего раствора пятикратным объемом соле0 вого раствора Грейса. Стерильные яйца помещают в термостат при 24-25°С для развития до начала выхода гусениц. Контами- нироаанный материал выбраковывают. Эмбрионы гусениц, т.е. яйца на стадии на5 чала выхода гусениц, измельчают механически в гомогенизаторе в солевом растворе Грейса с добавлением 100 ед./мл кзнамици- на. Отцентрифугированные клетки и кусочки тканей ресуспендируют в ростовой плательной среде, содержащей 90% среды

Грейса, 10% сыворотки эмбрионов с добавлением 100 ед./мл канамицина и энергично пипетируют. Подсчитывают количество жизнеспособных клеток, доводят их концентрацию до (4-5) 10s клеток на 1 мл ростовой средой и переносят в сосуд для культивирования. Миграцию и деление клеток наблюдают через 2,0-2,5 мес. Смену среды осуществляют через 10-15 сут небо- лее чем на 30%. После формирования 50- 60% монослоя клетки снимают со стекла в свежей порции ростовой среды и переносят в новый культуральный сосуд. Начиная с 10-15 пассажей пересевь) проводят 2 раз в неделю. Кратность рассева 1:3-1:5, посевная концентрация (2-3) 1Q5 кл/мл.

Полученный штамм клеток культивйру ют при 28°С в питательной среде состоящей из 90% среды Грейса и 10% сыворотки эмбрионов коров с добавлением 100 ед./мл канамицина. При посевной концентрации (3-4) 105 кл,/Мл-клетки формируют сетчатый монослой с островками многослойного роста к концу 5-7 суток (фиг. 1), Йосле снятия клеток мягки пй:й;0т й|эо1ванием; в свежей питательной ереЩ рассевают в пропорции 1:3-1:4, ВИдйШё; соответствие штамма клеток подтверЩафт .сравнительными анализами ка;риот:йп||вклбток гусениц исходного вида насёкомЩ; и клеток полученного штамма (фиг, 2 й;35;;;;.;; -;./;:: .;

Пример 2. Продукция%ируса цйтоп- лазматического полиэдроза ( совки клетками озимой совки штампа Шэ-ЮзС4 788..: :/ ::--: : ШШ---Л ;: : ...

Для тестирования йслоль ов1алй ВЦП озимой совки штамма ЦЛЬзС liar Коллекции ВНИИ молекулярной |inO Вектор, пос. Кольцово, Новосибирской области; ;- ; ; Hi: - ; / . -;v:- - r; : : M- ;.

Клетки озимой совки; культивируй Дй 30 пассажа, как описано в примере 1. ПёрёХ севаютеконцентрацииб 105кл,/млв7мл питательнбй среды в культуральныё сосуды объемом 50 мл и помещают в термостат при 28°С. Через 2 сут роста питательную среду сливают, клетки снимают со стекла в свежей порции питательной среды и перёсевакгг в новые культуральныё сосуды в концентрации (3-4) 105 кл/мл. Через сутки роста среду сливают, на образовавшийся слой наносят вирусную суспензию ВЦПОзС из расчета 0,1 мл суспензии/содержащей (1-2) 107TG 050 инфекционных вирионрв в 1 мл, на 3 см2 рабочей поверхности куль- турального сосуда, покрытого монослоем

клеток. ;. :..; -. ., -..-. .-... В качестве вирусной суспензии используют гомогенат больных -цитоплазматическим полиэдрозом гусениц озимой совки на 3-5 сутки после заражения. Для этого гусениц механически гомогенизируют в солевом растворе Грейса, насыщенном фенилтиомо- 5 чевйной, в соотношении 200 мг гусениц на 1 мл раствора. Титр вирионов определяют на TCIDso, используя метод обработки результатов Рйда-Менчё, в 96-ячеистых пластиковых плашках фирмы Flow Laboratories

0 (Англия).

Через бОмин после заражения культуры клетбк вирусную суспензий сливают, вносят свежую питательную среду и культивируют при 28°С в термостате. Анализ

5 продукции ВЦП проводят через 7 сут под световым мйкрЬскбпом в фазовом контрасте или с помощью окраски пикриновой кислоты фиксированных мазков по наличию телец включений & цитоплазме инфициро0 ванных клеток, V

Продуктивность кл(еток определяют подсчетом Среднего количества полиэдров В цитрплазме 100 инфицированных клеток. Долю заряженных клеток бпределяют по со5 отнощёнию количества зараженных клеток с полиэдрами к общему числу клеток. Выход вируса определяют подсчетом количества полиэдров в культуральнОй жидкости. Для этого инфйцирбваН ную клеточную культуру

0 дважды замора жи8а ют и оттаивают для освобожденийбйутриклетЬчного вируса в под- держибвющук среду определяют титр вируса в ка/лере Горяева; Титр равен 13,6 (10,1; 1б, 10б пол/мл.

5 Для определения йнфекцйонности поя- ученного вируса суспензию клеток, содержащую полиэдры, наносят на корм. Каждой из 1UO гусениц IVI йрзраста скармливают 10 зараженных клеток, взятых через 7 сут по0 еле их инфицированйя. Причину гибели определяют, делай мазки-отпечатки погибших насекомых, под сбетовым микроскопом. П р и мер 3. Продукция вируса ядерного полиэдррза озимой совки клетками рзи5 мой совки штамма МБ-0зО -788.

Для тестирования использоваяи ВЯЛ озимой совки штамма ВЯЛОзС из коллек- цйй ВНИИ молекулярной биологии НПО ёектор, Йовосйбирской области.

. Kлeтки штaMм И.Б-DзC4 -78)5.кyяtlTийи- руййг. Как описано в примере 1, пересевают, к заражению и инфицируют, как описано в примере 2, Используют для зара- жейШя суспензию, содержащую (1-5) -10

5 ТСШзо/|Цл вирионов ВЯЛ озимой совки. /Шализ продукции ВЯП проводят через 7-8 сут пад световым микроскопом в фазовом контрасте по наличию телец включений в ядрах: Ш) инфицированных клеток, Анализ инфекционное™ проводят, как описано в примере 2.

Анализ результатов репродукции вирусов ядерного и цитоплазматичёского поли- эдрозов озимой совки в культуре клеток озимой совки МБ-ОзС4-788, представленных в таблице, показал, что полученный штамм клеток можно использовать для наработки биомассы бэкуловирусов, поражающих опасного вредителя полей - озимой совки. Полученная вирусная биомасса однородна, без примесей чужеродного вируса, что позволяет проводить биохимические, генетические и молекулярно-биологичвские исследбвания ВЯПОзС и ВЦПОзС.

}; ; П р им е р 4. Продукция вирусов ядерного прлиэдрОна капустной совки клетками

Дозймой совки штамма МБ-ОзС4-788.

Для тестирования использовали ВЯП капустной совки щтэммое В ЯП КС-3-86 и ВЯП КС-ТО идi коллекции ВНИИ молекулярной биологии, НПО Вектор, Новосибир- ской области.; . Клетки штамма МБ ОзС4-788 культивируют, как описано в примере 1, пересевают. готовят к заражению и инфицируют, как описано в примерах 2 и 3. Анализ продукции ВЯП проводят, как описано в примерах 2 и

3.. У У,(. Результаты репродукции ВЯП КС-3 и КС-10 в культуре клеток МБ-ОзС4-788 представлены в таблице. j Таким образом показано, что полученный штамм клеток МБ-ОзС4-788 способен продуцировать различные бакуловирусы (ВЯПОзС, &ЯПКС-3-86, ВЯПКС-10 и ВЦПОэС) в количестве, достаточном для на- . работки вирусной биомассы для исследования в Г научных исследованиях биохимического, генетического, молёкуляр- но-биологического и вирусологического направлений.

Преимуществом полученного штамма перевиваемых клеток озимой совки А. segetum является то, что он способен про- дуцировать вирусы (ВЯП и ВЦП), поражающие гусениц озимой совки - опасного вредителя сельского хозяйства. Данные вирусы не продуцируются ни одной из имеющихся линий клеток насекомых ни в СССР, ни за рубежом.

Штамм может служить системой в экспериментальных исследованиях при получении, «локировании и отборе наиболее патогенных или вирулентных штаммов вирусов, а также для молекулярно-биологиче- ских и гённоинженерных исследований и для наработки рекомбинантных ВЯП и ВЦП.

Исследование охарактеризованных, проверенных на наличие контаминантов перевиваемых культур клеток-продуцентов данной группы вирусов, позволяет контролировать процесс наработки вирусной био- массы Г получать ее с однородными свойствами, без посторонних микроорганизмов. Отсутствие остатков кутикулы и уменьшение количества балластных белков уменьшает аллергенность, а значит, увеличивает экологическую чистоту получаемого препарата как при его производстве, так и при его применении. Технологичность, а, главное, мобильность производства обеспечивается возможностью сохранять клетки при температуре жидкого азота длительное время, что позволяет начинать процесс наработки вирусной биомассы в любое время. ;: : Полученный штамм перевиваемых клеток озимой совки A. segetum может также использоваться для наработки биомассы промышленного штамма энтомспатогенно- го вируса ядерного полиэдроза капустной совки ВЯПКС-3-86, Вирус задепонирован во всесоюзной коллекции вирусов Института вирусологии им. Д.И. Ивановского под номером ГК$ 2155 от 12.09.88 г. и применяется для получения энтомопатогенного препарата Вирин-КС (регламент ОПР T23.p17-90 на производство препарата разработан во ВНИИ молекулярной биологии НПО Вектор).

Формула изобретен и я Штамм перевиваемых клеток эмбрионов озимой совки Agrotis segetum (Schlff) № ВСКК А-28 для культивирования энтомопа- тогенных вирусов.

Продолжение таблицы

fcl