Штамм перевиваемых клеток яичников куколок хлопковой совки НеLIотнIS аRмIGеRа (НUвN.) для культивирования вирусов ядерного полиэдроза Советский патент 1993 года по МПК C12N5/00 A01N63/00 

Изобретение относится к вирусологии, в частности к культивированию клеток и тканей с целью наработки и изучения энтомопатогенных вирусов, и может быть использовано в сельском хозяйстве для получения энтомопатогенных препаратов.

Целью изобретения является получение стабильного штамма перевиваемых клеток хлопковой совки Helionhis armigera (НцЬп.), свободного от контаминантов культивируемого на доступных питательных средах, продуцирующего ВЯП хлопковой совки и других насекомых, значимых вредителей сельского хозяйства, который может быть

использован для наработки биомассы энтомопатогенных вирусов и их исследования.

Поставленная цель достигается тем, что получен новый штамм перевиваемых клеток яичников куколок хлопковой совки Heliothis armigera (Hubn.)MB-XC-685. Штамм депонирован в специализированной коллекции перевиваемых культур клеток насекомых Института общей генетики им. Н.И.Вавилова АН СССР (г. Москва) под номером ВСКК(Б)А-26.

Штамм перевиваемых клеток яичников хлопковой совки МБ-ХС-685, ВСКК (Б) А-26, получают трипсинизацией и механическим дроблением яичников 10-15 куколок хлопко00

о

00

о

д

о

Сл

вой совки, предварительно стерилизованных в течение 10 15 мин в 96° этиловом спирте. Выделение яичников и дальнейшие операции проводят в стерильном месте с соблюдением правил асептики. Клетки и мелкие кусочки тканей яичников отмывают в солевом растворе Грейса, содержащем пенициллин и стрептомицин до 1000ед./мл. После отмыва и центрифугирования осадок клеток и кусочков тканей ресуспенди- руют в свежей порции питательной среды Грейса с добавлением 10% по объему сыворотки эмбрионов коров и 100 ед./мл кана- мицина. Подсчитывают количество жизнеспособных клеток, доводят их концентрацию до (4-5) -10° клеток в 1 мл питательной средой. Суспензию клеток переносят в сосуд для культивирования. Миграцию и деление клеток наблюдают почти через 6 мес покоя клеток. Смену среды осуществляют 1-2 раза в месяц не более чем на 30% от объема. После формирования 50- 60%-ного монослоя через 6 мес после посадки клетки сбивают механическим способом в свежей порции среды и переносят на новый культуральный сосуд. Первые 5-10 пассажей пересевы осуществляют чаще, чем 1 раз в 2-3 недели. Начиная с 10 пассажа, пересев проводят. 1 раз в неделю. Кратность рассева 1:3-1:6, Через 15-20 пассажей клетки подвергают обследованию. Проводят морфологический и карио- логический анализы, контроль видовой идентичности с помощью сравнительного анализа изоферментов глюкоза-6-фосфат- дегидрогеназы (ГбФДГ) и лактатдегидроге- назы (ЛДГ), контроль контаминации проводят с помощью методов окраски ДНК флюорохромами и электронно-микроскопического анализа.

Морфологические свойства. Культура клеток МБ-ХС-685, ВСКК(Б)А-26 полиморфна, Преобладают эпителиоподобные клетки средних размеров. Ядро округлой формы с 1-2 ядрышками, Клетки формируют монослой с островами многослойного роста (фпг.1).

Контроль контаминации. По данным электронно-микроскопического анализа, изучения культуры клеток под люминесцентным микроскопом после окрашивания ДНК-флюорохромамй. микробиологического контроля путем еысева на набор селективных сред было выяснено, что клетки штамма свободны от вирусной, микоплаз- менной. грибковой и бактериальной контаминации.

Кариологичеокня характеристика Рас предалеииг числа хромосом определим подсчетом v.p.f fto .on R 100 метзфгЧ нм п ьч

стинках. На фиг.2, 3 представлены микрофотография метафазной пластинки и показано распределение числа хромосом в клетках штамма. Кариологический анализ показал,

что клетки штамма МБ-ХС-685 ВСКК(Б) А-26 имеют набор из 100-125 мелких голоцентри- ческих хромосом.

Идентификация штамма. На фиг. 4 представлены данные, характеризующие

изоферментный состав глюкозо-6-фосфат- дегидрогеназы и лактатдегидрогеназы в исследуемых клетках и исходных насекомых (гусеницы хлопковой совки V возраста). Показана идентичность изоферментного со5 става, что доказывает видовую специфичность и принадлежность к Hellothls armigera, полученного штамма клеток - МБ- ХС-685, ВСКК(Б) А-26.

Культуральные свойства. Клетки штам0 ма выращивают в монослое при 28°С в среде Грейса с добавлением 10% сыворотки эмбрионов коров. Тип роста - смешанный, посевная концентрация - (3-5) -10 кл/мл; снимают механическим встряхиванием ли5 бо пипетированием, пересевают через 5-7 сут культивирования.

Криоконсервация и хранение. Клетки штамма хранятся в ампулах в замороженном состоянии при температуре жидкого

0 азота (при-196°С). Ампулы заложены на хранение в коллекции клеточных культур НПО Вектор (п. Кольцове, Новосибирской обл.) и во Всесоюзной коллекции культур клеток насекомых Института общей генетики АН

5 СССР(г.Москва).

Режим замораживания. Снятые со стекла в свежей среде Грейса клетки центрифугируют и ресуспендируют в новой порции ростовой среды, содержащей 10% эмбрио0 нальной сыворотки плодов коровы, доводя концентрацию клеток до 5-10 млн.кл. в 1 мл. Медленно, при постоянном перемешивании, добавляют равный объем свежей ростовой среды, содержащей 10% сыворотки и

5 20% глицерина. Суспензию разливают в ампулы, замораживают в смеси спирта и жидкого азота, понижая температуру со скоростью 1 % в минуту до минус 40°С с последующим погружением в хранилище

0 биопродуктов с жидким азотом.

Восстановление культуры клеток осуществляют следующим образом: ампулу с клетками извлекают из жидкого азота и помещают в водяную баню с температурой

5 30-35°С. постоянно переворачивая, ампулу оттаивают. Ампулу с клетками вскрывают, соблюдая правила асептики суспензию размороженных клеток тфонос п п центри- фужную пробирку. Погци ;i постоянно iifpi Mi riiJHfias С интпгт ..,.:..: . ... . I.

ляют ростовую среду в количестве, составляющем 0,5: 0,5; 1; 2, 3 мл.

Суспензию центрифугируют, осадок ре- суспендируют в свежей ростовой среде, подсчитывают общее количество клеток, долю жизнеспособных, разводят ростовой средой до концентрации жизнеспособных клеток (2,5-3) 10 кл/мл и помещают в куль- туральный сосуд.

Полученный штамм перевиваемых клеток МБ-ХС-685 продуцирует вирусы ядерного полиэдроза хлопковой и капустной совок (ЗЯП ХС-1 и ВЯЛ КС-3). Продуцируемый клетками ВЯП идентичен исходному вирусу, полученному в гусеницах соответствующего вида насекомых, имеет типичную для ВЯП КС-3 и ВЯП ХС-1 морфологию, патогенен для гусениц соответствующего вида насекомых.

Поскольку полученный штамм клеток хлопковой совки Heliothis armlgera является единственным продуцирующим ВЯП Н. armlgera с одиночным включением вирио- нов в пучки и в литературе нет сведений о других линиях клеток, продуцирующих данный вирус, то предложенное изобретение (предложенный штамм) обладает существенными отличиями.

На фиг.1 приведена фотография клеток линии МБ-ХС-685, ВСКК(Б) А-26(нефиксиро- ванные и неокрашенные клетки ув.х400); на фиг.2 представлена микрофотография мета- фазной пластинки клеток линии МБ-ХС-685 (окраска азур-эозином); на фиг.З изображена диаграмма распределения числа хромосом в клетках культуры МБ-ХС-685 на разных пассажах; на фиг.4 приведена диаграмма изоферментного анализа штамма перевиваемых клеток хлопковой совки линии МБ-ХС-685; I - контроль - гусеницы хлопковой совки; II - клетки линии МБ-ХС-685; III - контроль - клетки Hela, а - Г6ФДГ; б - ЛДГ; на фиг.5 приведена фотография клеток хлопковой совки, инфицированных ВЯП хлопковой совки (ВЯП ХС-1) (нефиксированные и неокрашенные клетки, ув х 400); на фиг.6 представлена фотография клеток хлопковой совки, инфицированных ВЯП ка- пустной совки (ВЯПКС-3)(нефиксированные и неокрашенные клетки, ув. х 400).

Пример 1, Получение первичных культур клеток из яичников куколок хлопковой совки и поддержание их в культуре.

Куколки хлопковой совки разделяют по половым признакам. 10-15 куколок-самок отмывают стерильной дистиллированной водой от остатков корма и экскрементов. Отмытые куколки помещают в сосуд с 96% этиловым спиртом на 10-15 мин. Из стерильных куколок, соблюдая правила асептики, выделяют яичники, отмывают их в солевом растворе Грейса с добавлением 300 ед./мл канамицина. Отмытые яичники механически измельчают и трипсинизируют в течение 10-15 мин. Отмывают клетки и кусочки тканей от детрита.и трипсина в солевом растворе Грейса с канамицином. После от- мывэ и центрифугирования осадок клеток и

кусочков ткани ресуспендируют в порции питательной среды Грейса с добавлением 10% по объему сыворотки эмбрионов коров и энергично пипетируют. Подсчитывают количество жизнеспособных клеток, доводят

их концентрацию до(4-5) 105 клеток на 1 мл средой Грейса, содержащей 10% сыворотки и 100 ед./мл канамицина. Суспензию клеток переносят в сосуд для культивирования. Смену среды осуществляют 1-2 раза в месяц не более чем на 30%. Миграцию и

деление клеток наблюдают через 4-4,5 мес

после посева клеток, После формирования

50-60% монослоя клетки сбивают меха. ническим способом в свежей порции питательной среды и переносят на новый культуральный сосуд. Первые 5-10 пассажей пересевы осуществляют через 15-20 дней. Начиная с 10-15 пассажа, пересев проводят 1 раз в неделю, Кратность рассева клеток составляет 1:3-1:5; посевная концентрация

(2-3)- 105 клеток в 1 мл.

Полученный штамм клеток культивируют при 28°С в питательной среде, состоящей из среды Грейса, 10%. сыворотки эмбрионов крупного рогатого скота фирмы

Flow и 100 ед./мл канамицина. При-посев- ной; концентрации (3-4) -105 кл,/мл клетки формируют плотный монослой с островками многослойного роста к концу 7 суток роста (фиг.1), После снятия клеток мягким пипетированием в свежей питательной среде клетки пересевают.

Клетки идентифицируют с помощью изоферментного (фиг,4) и кариологического анализа (фиг.2 и 3),

П р и м е р 2. Продукция вирусов ядерного полиэдроза (ВЯП) клетками штамма МБ-ХС-685.

Для анализа используют вирусы из коллекции ВНИИ МБ НПО Вектор (п. Кольцо- во, Новосибирской области) штаммов ВЯП ХС-1 и ВЯП КС-3.

Для изучения вируспродукции берут культуру клеток, прошедшую не менее 40 пассажей с момента ее получения. Перед

инфицированием клетки культивируют, как в примере 1, пересевают с концентрацией 5-105 кл./мл в 7 мл питательной среды в культуральные сосуды объемом 50 мл м помещают в термостат при 28°С. Через 2 сут питательную среду сливают, а клетки снимают со стекла в свежей порции питательной среды. Пересевают клетки в концентрации 3 -105кл./мл в новые культуральные сосуды. Через сутки роста среду сливают, на образовавшийся монослой наносят вирусную суспензию в количестве 0,1 мл, содержащую 107ТСЮбО/мл вируса, на 3 см2 рабочей поверхности культурального сосуда, покрытого монослоем клеток,

В качестве вирусной суспензии используют гомогенат больных ядерным поли- эдрозом гусениц хлопковой совки (для наработки ВЯПХС-1)либо капустной совки (ВЯП КС-3). Гомогенат получают следующим образом: через 5 сут после заражения больных гусениц гомогенизируют в соле: вом растворе Грейса, насыщенном фенил- тиомочевиной, добавляя на 200 мг гусениц 1 мл раствора, Титр вирионов определяют по TCIDso с использованием-метода обра- ботки результатов Рида-Мёнча в 96-яче- истых пластиковых плашках фирмы Flow (Англия).

Через 60 мин после заражения клеток вирусную суспензию сливают, вносят свежую ростовую среду. Анализ продукции ВЯП проводят через 7 сут под световым микроскопом с помощью фазового контраста по наличию телец включений в ядрах инфицированных клеток. Для определения доли зараженных клеток подсчитывают среднее количество полиэдров в ядрах 100 зараженных клеток. Биоиспытания как вирионов, так и полиэдров проводят на гусеницах соответствующего вида насекомых. Для определения инфекционности вирионов 20 мкл культуральной жидкости, содержащей вирионы, вводят в гемоцель 100 гусениц 5 возраста через ложноножку. Для определения инфекционности полиэдров наносят суспензию клеток, содержащих полиэдры, на кусочки корма. Каждой из 100 гусениц скармливают 10 зараженных клеток на 7 сутки после заражения, Причину гибели определяют, делая мазки-отпечатки погибших насекомых, под световым микроскопом.

Результаты репродукции ВЯП ХС-1 и ВЯП КС-3 в клетках изучаемого штамма МБ- ХС-685, ВСКК(Б) А-26, представлены в таблице и на фиг.5,6. Показано, что штамм клеток МБ-ХС-685 ВСКК(Б) А-26 способен продуцировать ВЯП ХС-1 и КС-3 с сохранением вирулентности для насекомых соответствующих видов в количестве, достаточном для наработки вирусной биомассы. Преимуществом полученного штамма

перевиваемых клеток хлопковой совки Heliothis armigera линии МБ-ХС-685 является то, что он способен продуцировать промышленные штаммы вирусов ядерного полиэдроза совки Н.armigera - наиболее

опасного вредителя хлопчатника. Данный вирус не продуцируется ни в одной из линий клеток насекомых, имеющихся в СССР или за рубежом.

Штамм может служить системой в экспериментальных исследованиях при получении, клонировании и отборе наиболее патогенных или вирулентных штаммов ВЯП, а также для генно-инженерных исследований и для наработки рекомбинантных ВЯП.

Использование охарактеризованных, проверенных на наличие контаминантов перевиваемых культур клеток - продуцентов данной группы вирусов позволяет контролировать процесс наработки вирусного материала, получать его с однородными показателями, без посторонних микроорганизмов, а отсутствие остатков кутикулы и уменьшение количества балластных белков уменьшает аллергенность и, значит, увеличивает экологическую чистоту получаемого препарата как при его производстве, так и при его применении. Кроме того, возможность сохранять клетки насекомых при температуре жидкого азота длительное время

позволяет начинать и прекращать производство препарата в любое удобное время года, что значительно увеличивает мобильность производства.

Полученный штамм может использоваться для наработки биомассы энтомопа- тогенных вирусов промышленных штаммов ВЯП ХС-1 и ВЯП КС-3. В настоящее время подобную биомассу получают на соответствующих гусеницах согласно опытно-промышленным регламентам, разработанным во ВНИИ МБ НПО Вектор (ОПР 123.017-90 на производство Вирина-ХС, смачивающийся порошок и ОПР 123.016-90 на производство Вирина-КС, смачивающийся порошок)

и используют в сельском хозяйстве. Формула и гЗ обретения Штамм перевиваемых клеток яичников куколок хлопковой совкИ Heliothis armigera (Hubn.) ВСКК(Б) № А-26 для культивирования вирусов ядерного полиэдроза.

Среднестатистическое число полиэдров на 1 ядро зараженных клеток, определенное по 100 клеткам.

Использование: вирусология, получение средств защиты растений от вредных насекомых, в частности вирусных энтомопатогенных препаратов. Сущность изобретения: штамм перевиваемых клеток яичников куколок хлопковой совки Hellothis armlgera (Hubn.) получен трипсинизацией и дроблением яичников куколок с последующим вы- делением жизнеспособных клеток яичников. Штамм депонирован в коллекции пересеваемых соматических клеток беспозвоночных животных Института общей генетики им. Вавилова АН СССР под номером А-26. Использование вышеуказанного штамма клеток для культивирования вируса ядерного полиэдроза позволяет получить суспензию с титром (4,9-9,0)хЮ6 пол/мл. 1 табл., 6 ил. у Ё

Фиг. I

V-.

««

. .. .: ... . . «

. .

- .

«

.. «,:

А в V

«

А 6

« «

«

«

.

«

в

«

««

t;

А в V

А 6

« «

«

«

Фиг. 2

г клеток

26

82

1 18 14 ЮТ 6

2

МО 120 140

гоо гво эоо аво 400

. Фю . З

число

т т « «юсо1.

Фиг. 4

$

,о

Фиг. 5

., М ° ;- vvЈ .

.ЛШШЖ

.. . чжРш«.

.-v г ж« , - бд .%- ,:

&$ i2 : %РЩ 4 г &$% W С- -V ; i.г ч. Ф - Л; тл ;, .-. ,

Фиг. 5