Вещество, обладающее антикальциевым действием Советский патент 1993 года по МПК A61K31/37 

H04fWi () jf fiO;0

ХОЛ ЛОАО0 o-Sr o,1 l

-со-сн3

Изобретение относится к области медицины и касается применения вещества в качестве антикальциевым действием. Цель - повышение активности. Соединение 2,2 - диметил-3-окси-51,6,61,7-пиранокумарин предлагается в качестве вещества, обладающего антикальциевым действием,которое ранее было известно в качестве химического соединения.

Таким образом, представленные физико-химические и спектральные характеристики позволяют привести структурную формулу (1).

П р и м е р II. Испытания проницаемо- |сти эритроцитарных мембран под влиянием щекурсинола

| Анализ проводят следующим образом; |в 8 центрифужных пробирок наливают по 5 л рабочих растворов с возрастающим со- .ержанием мочевины. В первую пробирку яда наливают 5 мл изотонического раство- а хлорида натрия, в восьмую - 5 мл изото- ического раствора мочевины (0,3 М). Это эталон нулевого и 100% гемолиза. Затем в :аждую пробирку добавляют по 0,1 мл взве- и эритроцитов, осторожно перемешивают л оставляют стоять на 3-5 мин. Затем все тробирки центрифугируют при 1000 об/мин } течение 5 мин. В центрифугате определя- от степень гемолиза путем фотометрирова- -шя на Л.Ф.К-69 зеленым светофильтром в :ювете с рабочим расстоянием 1 см против (талонов, приготовленных из этой же пробы |ритроцитов. Интенсивность гемолиза расшиты ва ют о процентах по отношению к оп- ической плотности гемозата в пробирке № (100% гемолиз в изотоническом растворе гочевины).

Формула расчета: Дх 100Дмоч % гемолиза де Дх - оптическая плотность надосадоч- юй жидкости в пробирке с данной концен- рацией мочевины в рабочем растворе,

Дмоч-оптическая плотность надосадоч- юй жидкости в пробирке с изотоническим раствором мочевины (100% гемолиз).

Увеличение проницаемости характеризуется увеличением степени гемолиза, ее уменьшение-снижением процента гемоли- ia в пробе.

Опыты проводят на крысах в условиях in vivo и In vitro. Для сравнительной оценки

0

5

0

используют известный антагонист кальция - верапамил в дозе 10 мг/кг. Декурсинол вводят внутривенно в дозах 0,5-10 мг/кг. Через 2 часа животных декапитируют для забора крови. Для изучения действия веществ в условиях In vitro растворы добавляют к цитратной крови из расчета 0,2 мг на 5 мл крови. Полученные данные представлены на фиг.1.

Из графиков видно, что декурсинол уменьшает проницаемость эритроцитарных мембран в дозе 5 мг/кг, а в меньших дозах декурсинол не оказывает влиния на проницаемость мембран эритроцитов. Верапамил уменьшал проницаемость эритроцитарных мембран лишь в дозе 10 мг/кг.

Таким образом, декурсинол, как и его аналог верпзмил уменьшают проницаемость мембран эритроцитов, причем декурсинол в большей мере и в меньшей (в 2 раза) дозе, что свидетельствует об уменьшении проницаемости мембран для электролитов.

Пример III. Сравнительное испытание антикальциевого действия декурсинола и верапамила на изолированных сосудах.

Эксперименты проводят на изолированных препаратах воротной вены крыс 0 длиной 4-6 мм и массой в среднем 0,2-0,6 г. Гладко-мышечные клетки (ГМК) сосудов обладают спонтанной электрической и сократительной активностью в виде потенциалов действия и фазных сокращений. Спонтанная ритмическая активность ГМК воротной вены поддерживается в экспериментальных условиях без существенных изменений в течение нескольких часов и быстро восстанавливается после различного рода стимулирующих воздействий. Сосудистые препараты перфузируют раствором Кребса следующего состава (в ммоль/л): NaCI- 133, ,7, №НСОз 16,3, МаНРСм -1,38, CaCl2-2,5, MgCfc- 12. глюкоза-7,8, 5 рН - 7,4, температура 37°. Буферный рас5

5

0

твор насыщают газовой смесью, содержащей 16-21% кислорода, 74-79% азота и 5% углекислого газа. Для снижения РОа в буферном растворе содержание кислорода в газовой смеси уменьшают до 1 %, а для увеличения Р02 увеличивают содержание .кис-.; лородз до 80%. Контроль насыщения кислородом в буферном растворе осуществляют полярографическим методом. Биоэлектрические показатели (уровень мембранного потенциала, амплитуда и частота потенциалов действия) регистрируют с помощью метода сахарозного мостика. Участок ткани между отводящими электродами постоянно промывают изотоническим раствором сахарозы с высоким (не менее 10 - см) удельным сопротивлением, Благодаря этому электролиты практически полностью вымываются из внеклеточного пространства и замещаются раствором сахарозы. Тем самым исключает- Јя шунтирующее влияние электролитов вне- клеточной жидкости и создается возможность регистрировать максимально близкие к истинным величинам мембранного потенциала и потенциалов действия. Активность препаратов воротной вены зависит от концентрации ионов кальция.

Исследуемый сосудистый препарат помещают в 3-х секционную камеру, отсеки которой отделяются друг от друга тонкослойными резиновыми мембранами. Левая секция (тестируемая часть) перфузируется раствором Кребса, средняя - раствором сахарозы, правая - раствором КС..(120 ммоль/л). Электрическая активность отводится с помощью хлорсеребряных неполяризующихся электродов, погруженных в агар-агар и подается на вход катодного повторителя усилителя постоянного тока. Для регистрации сократительной активности клеток сосудистых гладких мышц сосудистый препарат (воротная вена крысы) фиксируют в перфузионную ячейку объемом 0,6 : мм, помещенную внутри камеры. Внутри камеры размещают также емкости для тестирующих растворов, механоэлектрический преобразователь, датчик температуры, нагревательные элементы регулирования и многовходовый распределительный кран. Одновременно с помощью механотропного преобразователя 6МХ1С регистрируют сократительную активность ГМК (спонтанные сокращения в изометрическом режиме). Регистрацию электрических и сократительных реакций проводят на диаграммой ленте автоматического потенциометра.

Для сравнительной оценки аникальцие- вого действия декурсионола используют ве- рапамил - известный антагонист кальция. В

условиях перфузии воротной вены нормально оксигенированным буферным раствором Кребса электрическая активность ГМК проявлялась в медленных изменениях мембранного потенциала в виде так называемых медленных волн деполяризации продолжительностью 2-4 с и амплитудой 2-4 мВ. На их фоне наблюдается появление разрядов потенциалов действия, состоящие из 3-7

пиковых потенциалов амплитудой 1-3 мВ, которые отражают вход Сэ2+ в ГМК. Сократительная активность характеризуется ритмическими фазными сокращениями амплитудой 3-4 мН и продолжительностью

3-5 с. Содержание декурсинола в буферном растворе определяли из расчета эффективной дозы вещества, которое оказывало в наших исследованиях противоаритмиче- ское и коронарорасширяющее действие, а

содержание верапамила - из расчета дозы, в которой он используется в терапевтической практике при сердечно-сосудистой патологии. Перфузия буферного раствора, содержащего 1 ДЕКУРСИНОЛА, приводила через 5-7 мин к полному торможению биоэлектрической и миогенной активности ГМК сосудов, что свидетельствует об антикальциевом действии соединения (фиг.2), При перфузии буферным раствором,

содержащим 1 верапамила отмечается, подобно перфузии декурсинолом, торможение проявлений биоэлектрической и миргенной активности ГМК сосудов, что видно на фиг.З.

Отмывание препаратов проводили тремя объемами физиологического раствора Кребса, после чего восстанавливалась авторитмическая активность ГМК. Таким образом, равноценный эффект на

биоэлектрическую и миогенную активность ГМК сосудов вызывает декурсинол в разведении 1 , а верапамил в разведении 1 , что свидетельствует о превышении активности декурсинола в сравнении с верапамилом в 10 раз. Введение норадреналина в концентрации 1 10 ммоль/л в нормально, оксигенированный раствор Кребса приводило к деполяризации мембраны на 6-8 мВ, увеличению частоты спонтанных потенциалов действия и фазных сокращений, т.к. норадреналин активирует резерв неактиви- ровэнных хемочувствительных потенциал- независимых Са-каналов. Возбуждающее действие норадреналина на ГМК сосудов

является результатом активации хемочувст- вительного входа Са +в клетку, управляемого альфа-адренорецепторэми. Эти данные позволяют сделать вывод, что один ид наиболее важных звеньев в цепи сопряжения

возбуждения с сокращением в ГМК является система трансмембранного пассивного Транспорта Са +, на которую оказывает вли- ние верапамил, как антагонист кальция, и декурсинол, который проявлял антикальциевое действие в наших исследованиях. Сни- хение кальциевой проницаемости фарколем ы миоцитов сосудистой стенки сопровождается падением входящего кальциевого тока, нарушением генерации потенциалов действия и фазных сокращений, уменьшением развиваемого ГМК уровня изометрического напряжения.

Таким образом, на основании проведенных экспериментов видно, что новое соединение декурсинол обладает антикальциевым действием, а по своей ак- УИВНОСТИ превосходит зерзпамил. I Пример IV. Испытание антикальцие- 1юго действия декурсинолэ по его влиянию на включение 5Са в отдельные структуры головного мозга,

i Влияние декурсинола на включение Т Са в нервные клетки отдельных структур оловного мозга изучено в экспериментах на 54 крысах. Крысам внутрибрюшинно вводят декурсинол в дозах 1 и 10 мг/кг, верзпа- лил в дозах 10 20, 30 и 40 мгг/кг и здновременно всем крысам вводят °Са из расчета 38 мк БК 1 мк С на 100 г массы кивотных. Контрольным животным вводят физраствор и Са. Животных через 30 мин декапитируют, извлекают мозг, по возмож- юсти освобождают его от крови и помеща- от в чашку со льдом. Выделяют отдельные области мозга (гипоталамус, кору) и подвер- j-ают их гидролизу в 1 н NaOH (0,7 мл) при J50°C в течение 30 мин. Гидролизат нейтрализуют 1 мл 0,67 н HCI. Включение 4°Са определяют по уровню радиоактивности в гидролизате ткани (имп/мин на 1 мг белка), которую определяют в жидкостном счетчике | Магк-3, Для этого 1 мл гидролизата вносят

0

во флаконы с 10 мл сцинцилляционного раствора ЖС-8. Белок определяют по Лоури.

При введении декурсинола в дозе 1 мг/кг нами не отмечено ингибирования 5 включения 45Са в нервные клетки изучаемых структур головного мозга (гипоталамусе и коре). При введении декурсинола в дозе 10 мг/кг нами отмечен высокий процент ингибирования включения 45Са в нервные клет0 ки гипоталамуса и коры - количество импульсов в тканях гипоталамуса уменьшилось и составило 87%, а в коре процесс ингибирования был выражен в большей мере - количество импульсов при этом соста5 вило 54%, что свидетельствует об угнетающем влиянии декурсинола на проницаемость нейрональных мембран для 45Са. Верапамил в дозах 10, 20 и 30 мг/кг не оказывал ингибирующего влияния на включение 45Са в изучаемых структурах головного мозга. В дозе 40 мг/кг верапамил ингибировал включение Са в гипоталамусе - количество импульсов при этом уменьшилось до 91%, а в коре до 85%, т.е.

5 ингибирующее влияние верапамила выражено в меньшей мере, чем декурсинола, который вызывал более выраженный эффект уже в дозе 10 мг/кг,

Таким образом, способность декурси0 иола ингибировать включение Са в отдельные структуры головного мозга (гипоталамус, кора) свидетельствует о том, что он проникает через гематоэнцефаличе- ский барьер и оказывает угнетающее влия5 ние на проницаемость нейрональных мембран для 5Сз. Отмечена большая активность декурсинола по сравнению с верапа- милом (декурсинол превышает активность верапамила в 4 раза).

0 Формула из об р етения|

Применение 2,2 -диметил-3-окси- 5 ,6,6 ,7-пиранокумарина в качестве вещества, обладающего антикальциевым действием.