СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММУНОМОДУЛИРУЮЩЕГО ПРЕПАРАТА Российский патент 1998 года по МПК A61K35/38 

Предлагаемое изобретение относится к медицине, в частности к получению препарата, обладающего выраженной биологической активностью и специфическим воздействием на иммунную систему.

Известен способ получения "тимарина" из тимусов крупного рогатого скота (Морозов В. В. с соавт. Докл. АН СССР, - 1977 - т. 233. - N 3. - стр. 491 - 494).

Недостатки известного способа: дефицит исходного сырья; трудности выделения тимуса; его малая масса; незначительный выход биологически активных веществ; высокая продажная стоимость иммуномодулирующих препаратов тимуса.

Цель изобретения - расширение арсенала иммуномодулирующих препаратов и снижение их стоимости.

Поставленная цель достигается тем, что согласно известному способу получения "тимарина", предусматривающему гомогенизацию тимуса, центрифугирование, нагревание надосадочной жидкости с последующим охлаждением, обработкой ацетоном, осаждением белков и липидов и пропусканием смеси через хроматографическую колонку, большой сальник крупного рогатого скота обезжиривают по ранее разработанному способу (И.И. Марков, патент СССР N 1800995 от 1993 г. ), фильтрат центрифугируют, надосадочную жидкость нагревают до +80^oC и фильтруют через широкопористый фильтр для удаления остатков жира. После обработки смеси ацетоном, повторного осаждения сульфатом аммония, центрифугирования, сухое вещество растворяют в 0,1 М трис-HCl буферном растворе /pH 7,5 - 7,8/, пропускают через хроматографическую колонку и получают чистый конечный продукт (фракция-5).

Способ осуществляется следующим образом.

В убойном цехе мясокомбината большие сальники крупного рогатого скота промывают в проточной воде и укладывают в полиэтиленовые пакеты со льдом. В дальнейшем их хранят в холодильниках при температуре -4-6^oC. Затем большие сальники обезжиривают. Фильтрат центрифугируют (12•10⁵ q•мин), удаляют осадок, а супернатант (фракция-1) нагревают до +80^oC и фильтруют через мягкий широкопористый фильтр и снова центрифугируют (12•10⁵ q•мин). Супернатант (фракция-2) охлаждают до +20^oC и добавляют охлажденный до -4^oC ацетон до конечной концентрации раствора 50%. Полученную суспензию центрифугируют (12•10⁵ q•мин), после чего полученный осадок (фракция-3) растворяют сульфатом аммония при конечной концентрации 25%. Смесь тщательно перемешивают и центрифугируют (12•10⁵ q•мин). Осадок (фракция-4) отбрасывают, а к супернатанту добавляют сульфат аммония до конечной концентрации 50%. Смесь тщательно перемешивают, центрифугируют (12•10⁵ q•мин), осадок (фракция-5) растворяют в 0,1 М трис-HCl буферном растворе (pH 7,5 - 7,8), наносят на колонку, заполненную сефадексом У-25. Элюцию проводят в 0,1 М трис-HCl буферном растворе (pH 7,5 - 7,8). Полученный материал лиофилизируют.

Пример. Большой сальник коровы получен в убойном цехе Самарского мясокомбината. Фрагмент сальника весом 1 кг доставлен на кафедру биохимии университета в полиэтиленовом пакете. Хранился в холодильнике при -4^oC в течение 48 ч. Размороженный при комнатной температуре фрагмент сальника измельчают ножницами и растирают с кварцевым песком в 0,1 М трис-HCl буферном растворе, содержащем 0,1 М KCl при pH 7,5. Соотношение ткани и буферного раствора как 1;2. Затем измельченную массу перемешивают, нагревают до температуры +50^oC и сразу фильтруют через 8 слоев марли. Фильтрат охлаждают до температуры +40^oC, после чего жир (липидную фракцию) отделяют фильтрованием через мягкий широкопористый фильтр. На фильтре - жир (фракция общих липидов). Фильтрат центрифугируют (12•10⁵ q•мин) и после удаления осадка получают 1-ю фракцию. Надосадочную жидкость сливают в колбу из термостабильного стекла и помещают в водяную баню, температуру которой постепенно доводят до +80^oC. Колбу вынимают из бани и охлаждают до +20^oC. Затем следует центрифугирование жидкости (12•10⁵ q•мин). Полученный супернатант является 2-й фракцией. Супернатант смешивают с охлажденным (-4^oC) ацетоном (ХЧ) в соотношении 1: 5. Смесь центрифугируют (12•10⁵ q•мин), полученный осадок (фракция 3) растворяют в сульфате аммония при конечной концентрации 25%. Смесь перемешивают и центрифугируют (12•10⁵ q•мин). Осадок (4-я фракция) отбрасывают, а к супернатанту добавляют сульфат аммония до конечной концентрации 50%. Смесь перемешивают и центрифугируют (12•10⁵ q•мин). Полученный осадок (5-я фракция) растворяют в 0,1 М трис-HCl буферном растворе (pH 7,5 - 7,8) и лиофилизируют. После чего высушенный материал растворяют в 50 мл трис-HCl буфера и пропускают через хроматографическую колонку (сефадекс У-25). Элюцию проводят при скорости 50 мл/ч и температуре +30^oC.

Получено два пула белков: 1) свыше 5 кДа; 2) от 1 до 5 кДа. Каждую из полученных фракций отбирали отдельно (5,1 и 5,2 соответственно) и упаривали до конечных объемов: 5,1 - 2,0 мл (концентрация белка - 7,2 мг/мл) и 5,2 - 2,1 мл (концентрация белка - 7,2 мг/мл). Полученное вещество представляет собой белые кристаллы, хорошо растворимые в воде. Конечный выход продукта из 1 кг сырого большого сальника - примерно 100 мг лиофилизированной фракции-5, а из обезжиренного сальника - примерно 250 мг.

Выход аналогичного продукта "тимарина", полученного из тимуса крупного рогатого скота по известному способу - 120 мг/кг (фиг. 1а, б).

Для сравнения биологической активности стандартного "тимарина" и препарата, полученного по предлагаемому способу, были проведены серии опытов на линейных мышах, зараженных Salmonella typhimurium. Всего было заражено 30 мышей. Результаты опытов показывают, что биологическая активность предлагаемого иммуномодулятора из большого сальника крупного рогатого скота выше биологической активности "тимарина".

"Иммуномодулирующий" препарат не обладает токсичностью: дозы 10 - 15 мг/г, введенные одномоментно внутрибрюшинно белым крысам, не вызывали их гибели. В опытах на белых крысах (12 животных) оценивались иммунологические показатели: лимфопоэтическая функция, фагоцитарная активность нейтрофильных лейкоцитов, количество эритроцитов и тромбоцитов до и после введения иммуномодулирующего препарата (табл. 2).

Определение радиозащитного действия иммуномодулирующего препарата проведено на 75 белых крысах. Животным контрольной группы (25) вводили подкожно физиологический раствор. Через 24 ч после введения крысам препарата (по 0,1 мг/г) (I группа - однократно, II - двукратно, III - трехкратно) и физиологического раствора, их облучали γ-излучением (⁶⁰Co) на установке "ЭКУ-50". Доза облучения - 725 рад, ЛД 90/30, мощность 82 рад/мин. Радиозащитное действие иммуномодулирующего препарата оценивалось по числу крыс, выживших в течение 30 сут после облучения (табл. 3).

Иммуномодулирующий препарат "ин витро" был исследован на: чувствительность к нему лимфоцитов крови человека, кролика, мыши; чувствительность к нему лейкоцитов крови человека, кролика, мыши; чувствительность к нему ткани селезенки; наличие продуктов гуморального иммунного ответа в различные фазы иммуногенеза.

Для работы была использована кровь 10 доноров, в том числе кровь одного больного нейродермитом. Приготовлено 6 препаратов по реакции розеткообразования, 16 препаратов по фагоцитарной активности лейкоцитов. Семь мышей иммунизировали эритроцитами барана (контроль - 3 мыши). Для морфологического исследования взято 6 органов: селезенка, сердце, печень, легкое, тонкая кишка, толстая кишка, лимфатические узлы.

Установлено, что 0,1% раствор иммуномодулирующего препарата активирует рецепторную активность лимфоцитов, количество розеткообразующих клеток увеличивалось до 89% (в норме 60%) и стимулирует активность фагоцитов; гемолизины в крови мышей обнаруживались на 7 сутки после их иммунизации эритроцитами барана. Появление циркулирующих антител устранялось одновременным введением животным 1 мг/г иммуномодулирующего препарата.

Таким образом, предлагаемый способ по сравнению с известным позволяет увеличить выход конечного целевого продукта в 2 раза и устранить дефицит исходного сырья для производства иммуномодулирующих препаратов.

Иммуномодулирующий препарат, полученный предлагаемым способом, обладает выраженной биологической активностью: на 33% повышает защиту мышей от инфекции по сравнению с "тимарином"; повышает устойчивость белых крыс к γ-излучению; на 29% повышает рецепторную активность лимфоцитов по сравнению с контролем; усиливает активность фагоцитов; предотвращает образование циркулирующих антител у мышей, иммунизированных эритроцитами барана.

Способ получения иммуномодулирующего препарата из обезжиренного большого сальника крупного рогатого скота включает измельчение сальника, фильтрацию, центрифугирование, обработку ацетоном, сульфатом аммония и хроматографическую очистку в 0,1 М трис-HCl буферном растворе pH 7,5-7,8. Способ обеспечивает получение препарата, который представляет собой два пула белков низкой молекулярной массы и стимулирует общую иммунологическую активность организма. 3 табл., 1 ил.

Способ получения иммуномодулирующего препарата путем гомогенизации сырья животного происхождения, центрифугирования, обработки ацетоном с последующей хроматографической очисткой целевого продукта, отличающийся тем, что в качестве сырья используют большой сальник крупного рогатого скота, который обезжиривают, после измельчения фильтруют, фильтрат центрифугируют, надосадочную жидкость нагревают до 80^oС, центрифугируют, охлаждают, смешивают с охлажденным до -4^oС ацетоном в соотношении 1:5, центрифугируют, осадок растворяют в сульфате аммония 25%-ной концентрации, снова центрифугируют, супернатант обрабатывают сульфатом аммония 50%-ной концентрации, смесь центрифугируют, осадок растворяют в 0,1 М трис-HCl буферном растворе pH 7,5 - 7,8, лиофилизируют и перед хроматографией сухой материал растворяют в том же буферном растворе.