Способ получения химопапаина Советский патент 1993 года по МПК C12N9/50 A61K37/54 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способу получения химо- папаина высокой чистоты с высокой специфической активностью из сырого хи- мопапаина посредством гель-хроматогра- фии.

Цель изобретения - ускорение способа и увеличение удельной активности целевого продукта.

Сущность изобретения заключается в том, что сырой химопапаин в присутствии восстановителя растворяют в воде или в буферном растворе, прозрачную надосадоч- ную жидкость раствора подвергают гель-хроматографии, и содержащие активный фермент фракции собирают и подвергают сушке вымораживанием. Сырой химопапаин обычно растворяют в фосфатном или ацетатном буферном растворе с величиной рН 5-7, который содержит в качестве восстановителя цистеин, меркаптоэ- танол или сульфит натрия. В качестве хроматографической колонки обычно нахо- дат применение колонка из Сефадекса G-50

или Сефадекса G-25, которую предварительно уравновешивают при помощи буферного раствора или солевого раствора, преимущественно при помощи содержащего цистеин фосфатного буферного раствора. В интересах эффективной хроматографии колонку выбираюттаким образом, чтобы длина относилась к диаметру как 5-50:1, предпочтительно как 20:1.

Замораживание проводят при -20 до - 70°С, предпочтительно при -40°С, лед удаляют в вакууме при давлении между 1,333 Рв и 13,33 Ра, предпочтительно 6,666 Ра, известным образом.

Дающее с хлористым барием осадок, неприятно пахнущее вещество находится в хроматографическом пике, который следует за активным ферментом.

Способ по изобретению имеет следующее преимущество.

Удаление ответственной за вредные побочные действия, дающей с хлористым барием осадок белковой компоненты путем гель-хроматографии дешевле, мягче и в деел С

00 СлЗ 00

.N О v|

OJ

сять раз быстрее, чем известные способы. Поэтому способ по изобретению также значительно пригоднее для осуществления в крупном промышленном масштабе, чем ионообменная хроматография. которая продолжается около.40 ч. За это продолжительное время фермент неизбежно повреждается. Гбль-хроматография, напротив, может осуществляться в течение А часов и дает возможность защищать фермент химическим путем - физиологически безвредными, ионными восстановителями. Так как гель-хроматография имеет более высокую степень разделения, полученный продукт гораздо чище, что - как и следует ожидать - приводит к существенному ослаблению побочных действий.

Способ поясняется чертежом. Пример 1.2,5 г сырого химопапаина растворяют в 135 мл содержащего 10 мМ цистеинфосфатного буферного раствора (3 мМ.рИ 6,5). Если раствор мутный, то его фильтруют/Через 10-30 мин хроматографи- руют 135 мл раствора на колонке с Сефадек- сом G-25 (4 х 100 см) с буферным раствором, который содержит 3 ммол фосфата и 1 ммол цистеина и имеет величину рН 6,5,

Первый пик (обозначенный на фиг, 2 при помощи А) содержит химопапаин, около 1,3 г. Пик В содержит образующее с хлористым барием осадок, неприятно пахнущее, неактивное вещество.

Находящийся в пике А фермент фильтруют в стерильных условиях и подвергают лиофилизации,

Активность химопапаина в любом случае определяли при насыщении субстратом (сложном бензилоксикарбонилглицин-р- нитрофениловом эфире (ZGN) в следующей реакционной смеси:

100 /1л приготовленного с ацетонитри- лом ZGN-раствора с концентрацией 1 мг/мл,

2,8 мл 0,1 М ацетатного буферного раствора с величиной рН 5,5 который содержит 1 мМ ED Та,

100 fin химопапаина. Для характеристики препаратов указывают ниже измеряемое при 25°С в течение 1 мин при длине волны 340 им изменение оптической плотности (экстинкции). которую вызывает 1 мг химопапаина на 1 мл реакционной смеси (Е).

Полученный фермент имеет активность 62 Е.

Пример 2. Работают по описанному в примере 1 методу, но колонка имеет больший диаметр (5 х 100 см). Удельная активность 70 Е.

П р и м е р 3. Работают по описанному в примере 1 методу, но применяют короткую колонку (10 х 16 см). Здесь не происходит никакого отделения образующего с хлористым барием осадок вещества от химопапаина. Удельная активность 42 Е.

Пример 4. Работают по описанному в примере 1 методу, но примененный для хроматографии буферный раствор не содержит цистеина, удельная активность 51 Е.

П р и м е р 5. Работают по описанному в примере 1 методу, но приготовляют более концентрированный раствор из химопапаина (содержание белка 5% - вес/объем.%).

5 Удельная активность 55 Е.

Пример 6. Работают по описанному в примере 1 методу, но выделение производят не при комнатной температуре, а при 2-10°С. Удельная активность 65 Е.

0 Пример. Работают по описанному в примере 1 методу, но вместо Сефадекса G-25 применяют Сефадекс G-50. Удельная активность 53 Е.

П р и мер 8. Работают по описанному

5 в примере 1 методу, но концентрация фосфатного буферного раствора составляет не 3 мМ, а 10 мМ. Удельная активность 63 Е.

Пример 9. Работают по описанному в примере 1 методу, но вместо фосфатного

0 буферного раствора с рН 6,5 применяют ацетатный буферный раствор с величиной рН 5,5; Удельная активность 67 Е;

Пример 10. Работают по описанному в примере 1 методу, но буферный раствор

5 содержит не 1 мМ цистеина, а 5 мМ цистеина.. Удельная активность 64 Е.

Пример 11. Работают по описанному в примере 1 методу, но к содержащей активное вещество фракции (пик А) в пересчете

0 на имеющийся белок, добавляют 10 вес.% цистеина. Удельная активность 63 Е.

Пример 12. Работают по описанному в примере 1 методу, но в качестве восстановителя вместо цистеина применяют сульфит

5 натрия. Удельная активность 60 Е,

Пример 13. Работают по описанному в примере 1 методу, но из всех трех хрома- тографических пиков отбирают пробу по 1 мл объемом и к каждой пробе добавляют 0,2

0 мл-нг соляной кислоты и 0.2 мл 12%-ного раствора хлористого бария. Осадок образуется только во фракции В.

П р и м е р 14. Активность примененного в качестве эталона препарата химодиактив5 на R (Smith Laboratories Ins.. США) измеряют указанным в примере 1 методом. Она составляет 28 Е.

Таким образом, использования предложенного способа позволяет быстро отделить с помощью гель фильтрации

ингибирующий компонент (в 10 раз быстрее, чем с помощью ионообменной хрома- то рафии) и получить препарат с более высокой активностью, чем известные (51-70 Е вместо 28).

Формула изобретения Способ получения химопапаина, предусматривающий растворение неочищенного папаина в буфере, хроматографическую очистку в присутствии восстановителя SH-группы и лиофильную сушку, отличающийся тем, что, с целью ускорения способа и увеличения удельной активности целевого продукта, растворяют химопапаин в фосфатном или ацетатном буфере с рН 5-7, а хроматографическую очистку проводят методом гель-фильтрации на сефадексе G-25 или сефадексе G-50. .

Использование: биотехнология, может найти применение в клинической практике. Сущность изобретения: сырой химопапаин в присутствии восстановителя растворяют в буферном растворе - фосфатном или ацетатном с рН между 5-7. Прозрачную надоса- дочную жидкостьподвергают хроматографической очистке методом гель- фильтрации на сефадексе G-25 или сефадек- се G-50, содержащие фермент активные фракции собирают и сушат вымораживанием. Получают химопапаин G удельной активностью 51-70 Е.