Способ выделения оксидазы @ -аминокислот из яда гюрзы Советский патент 1983 года по МПК C12N9/06 

im П50 1550 то 1950 «50 2Ш

СП Сл

о: со 2S50 fu, g5WC4WJff//« Изобретение относится к выделению оксидазы L-аМинокислот - фермента , катализирующего реакции окислительного дезаминирования L-аминокислот с образованием оС-кетокислоты. Оксидаза ь-аминокислот исполь зуется как для препаративного получения тироксина, чистых с-изомеров аминокислот it ci-кетокислот, так и для различных аналитических целей при изучении процессов транспорта аминокислот в процессе синтеза белка Оксидаза L-аминокиелот содержится во многих тканях животных (печень птиц), в микробах и в биологических жидкостях животных (змеиные яды). . Получение оксидазы ь-аминокислот из тканей животных и из микробов не обеспечивает чистоту фермента, так как источники фермента представляют многокомпонентную смесь различных ;белков, разделение которых является сложной задачей. Наиболее эффективны источником фермента являются змеиные яды, так как стабильность структуры яда обеспечивает четкое разделение. Активность оксидазы L-аминокислот в ядах различных змей варьируется. Это связано с видовой специфи ностью ядов, а также зависит от места обитания и условий существования змей. Исследование ядов среднеазиатских змей показало, что наибольшей активностью оксидазы L-аминокислот облада ет яд гюрзы. Это и определяет выбор яда гюрзы в качестве источника для н|ыделения фермента.. Известен способ выделения оксидазы L-аминокислот из яда гюрзы путем растворения яда в воде, осаждения белков сульфатом ,гельфильтрации на сефадексе G-100 в присутствии фосфатного буфера с рН 7,8 и обессоливания ферментной фракции на сефадексе G-25. Достигаемая степень очистки фермента 5,4-7,0 Cl Наиболее близким по достигаемому результату и технической сущности является способ вьщеления оксидазы L-аминокислот из яда гюрзы, предусматриваюсдий растворение яда в 0,05 М фосфатном буферном растворе с рН 7,8 с последующим центрифугированием-, гель-фильтрацию полученной надосадочной жидкости на сефадексе G-100. Затем фракцию, содержащую ферментативную активность, обессоливаит, высушивают лиофильно и растворяют в 0,0025 М фосфатном бу фере, после чего осуществляют хроматографию на ДЭАЭ-целлюлозе с элюацией фермента 4-ступенчатым градиентом NaCl (0,1-0,4 М) В 0,05 М фосфатном буфере, рН 7,8 С2. Однако слабоосновной анионит ДЭАЭ-целлюлоза - не является селективным ионообменником при очистке оксидазы Ь аминокислот. Фермент элюируется. совместно с основным количеством белка после первой ступени ионной силы (0,1 М NaCl).Достигается только 3-кратная очистка, причем потери активности доходят до 31%. Степень очистки - 15,3 раза. Выход оксидазы L-аминокислот 65,4%. Таким образом, недостатком способа является низкий выход оксидазы L-аминокислот и невысокая степень очистки. Целью изобретения является повышение выхода и степени очистки оксидазы L-i:lMИHOKИCЛOT. Поставленная цель достигается предлагаемым способом выделения оксидазы L-аминокислот из яда гюрзы, предусматривающим растворение яда в буферном растворе с последующим центрифугированием, гель-фильтрацию полученной надосадочной жидкости на сефадексе 0-100 и хроматографию ферментсодержащего раствора на колонке с ионообменной смолой с элюацией фермента солевым раствором,причем растворение яда и гель-фильтрацию осуществляют с использованием в качестве буфера 0,19-0,21 М раствора уксуснокислого аммония, рН 6,4-6,6, получейнйй гГбсле гельфильтрации ферментсодержащий раствор подвергают перед.хроматографией обессолинанию диализом до удельной электропроводности (1,6-1,8) х . X 10-3S см- (0,019-0,21 М)и устанавливают в нем рН 5,3-5,5,в качестве ионообменной смолы используют карбоксиметилцеллюлозу а в.качестве элюирующего солевого раствора 0,019-0,021 М раствор уксуснокислого аммония, рП 5,3-5,5. АММОНИЙ уксуснокислый является очень ;гигроскопичным1 веществом и с целью приготовления хорошо воспроизводимых буферных растворов, необходим контроль удельной электропроводности раствора. Удельная электропроводность рассчитывается по формуле УЭ |- (S - см-) m где К - константа ячейки кондуктометра} сопротивление раствора. Ом. Предлагаемый способ обеспечивает повышение степени очистки до 25 раз и повышение выхода до 85% оксидазы L-аминокислот. Использование уксуснокислого аммония в качестве буфера на стадии растворения обеспечивает создание среды для последующего разделения. Гель-фильтрации подвергают раствор яда гюрзы, разделение происходит на геле, причем в качестве геля используется сефадекс G-100 сверхтонкий, разделяющий белки в пределах молекулярного веса 4000-150000 Дальтонов. Яд гюрзы, содержащий мно гокомпонентную смесь, разделяется н 9 белковых пиков (см. чертеж;. I, III - IX пики исключаются, поскольку в них присутствуют эндонуклеазы, протеазы, фосфолипазы А, токсины, яда и другие вацества; Степень очистки 5-6 раз, вькод 95%. Последующей ионообменной хроматографии подвергают фракции II пика гель-фильтрации, причем удельную электропроводность.раствора уменьшают с диализом до (1,6-1,8) х X . см-, (0,019-0,021 М) рН 6,4-6,6, одновременно концентрируя раствор до 40 мл. рН раствора доводят до 5,3-5,5 с помощью 20%-ной уксусной кислоты. В качестве ионита используют избирательно действующую карбоксиметилцеллюлозу и проводят селективное разделение. На ионит наносят раствор фермента с удельной электропроводностью (1,6-1,8 ) 1(5% -с 0,019-0,021 М, рН 5,3-5,5. При этом оксидаза L-аминокислот проходит ион обменник, а остальные белки связываются катионитом. Таким образом, предлагаемый способ заключается в следующем. Яд гюрзы растворяют в растворе уксуснокислого аммония, центрифугируют,, осадок выбрасывают, надосадоч ную жидкость используют для гельфильтрации. Гель-фильтрацию проводя с раствором уксуснокислого аммония 0,19-0,21 М с удельной электропроводностью 14 ,5-15,5 ) - см-, рН 6,4-6,6. Пoлyчeннy э фракцию окси дазы L-аминокислот с приблизительно одинаковым молекулярным весом: обессоливают и концентрируют при по мсяди диализа с полиэтиленгликолём до удельной электропроводности (1,6-1,8) - см-, (0,019-0,021 Полученный раствор фермента, рН 5,3-5,5, наносят на колонку с карбо симетилцеллюлозой. Оксидаза L-амино кислот проходит катионит, а остальные белки (фосфодиэстераза, щелочная фосфатаза, 5-нуклеотидаза) связываются катионитом при рН 5,3-5,5 и удельной электропроводности раствора (1,6-1,8) -lO-s см,-, (0,0190,021 М). Фракции оксидазы L-аминокисяот собирают и концентрируют при помощи диализа с полиэтиленгликолём. Выход 853. Степень очистки - 25раз.60 АКТИВНОСТЬ оксидазы L-аминокислот 5 ед/мР белка.. Пример 1. К 4,9 г яда гюрзы добавляют 40 мп 0,19 М раствора . 55 I уксуснокислого аммония с удельнбй электропроводностью 14,5-10 S -см рН 6,4. Смесь медленно перемешиваюв течение 4 ч при . Растворенный яд центрифугируют при 5000 об/мин при 4с в течение 30 мин. Осадок выбрасывают, надосадочную жидкость используют для гель-фильтрации. На уравновешенную 0,19 М раствором уксуснокислого аммония (удельная электропроводность 14,5 ) колонку с сефадексом G-100 сверхтонг. КИМ (размеры колонки 4,2x140) наносят раствор яда. Колонку элюйруют 0,19 М раствором уксуснокислого аммония с удельной электропроводностью 14,5 - 10 SCMV рН 6,4, со скоростью 13 мл/ч и собирают фракции до 19 мл. Оптическую плотность элюата регистрируют непрерывно спомощью Увикорд-11.Получают ;9 белковых пиков. Во II пике фракции, ко торые имеют активности оксидазы L-аминокислот, объединяют (объем 200 мл) и подвергают диализу до выхода 40 мл желтого раствора белка с удельной электропроводностью 1,6 , 0,019 М; доводят рН 20%-ной уксусной жислотрй до рН 5,3. Раствор фермента наносят на уравновешенную 0,019М растворсм уксуснокислого аммония (удельнгш электропроводность 1,6 - , рН 5,3) колонку карбоксиметилцеллкшозы 1Ш-52. Через колонку пропускают 0,5 л раствора уксуснокислого аммония, рН 5,3 (удельная электропроводность раствора 1,5 .см). Скорость элюации 45 мл/ч, собираются фракции по 15 Mrt. Оптическую плотность элмата регистрируют непрерывно с помощью Увикорда ; Во фракциях определяют активность оксвдазы L-аминокислот (субстрат - L-лейцин). При ионообменной, хроматографии на КМ-целлюлозе оксидаза L-аминокислот проходит в данных условиях, а остальные белки, имеющие изоэлектрическую точку выие 5,3, связываются катионитом. Фракции, содержащие активности оксидазы L-аминокислот, объеиняют (выход 140 мл) и концентрируют при помощи диализа. Характеристика препарата - 85,2%, степень очистки 25,0 раза, активность оксидазы Ь-аминокислот - 5,0 ед/мр белка. Пример 2. К$,0г яда -добавляют 40 мл 0,2 М раствора уксуснокислого аммония с удельной элект ропро одностью 15, , -„ , .. f «|- медленно перемешивают ч. Растворенный яд центрифугируют Р бОО оС/мин в течение 30 мин при 4 с. Осадок выбрасывают, надосадочную жидкость используют для гель(фильтрации. На уравновешенную 0,2 М

раствором уксуснокислого аммония (удельная электропроводность 15,0 X -см) колонку с сефадексом G-100 сверхтонким (размер колонки 4,2x140 см) наносят раствор яда. Колонку элюируют 0,2 М раствором уксуснокислого аммойия с; удельной электропроводностью 15,0 - -см рН 6,5, со скоростью 13 мл/ч и собирают фракции по 19 мл. Оптическую плотность элюата регистрируют непрерывно с помощью Увикорд-11. Получают 9 белковых пиков. Во II пике фракции, которые имеят активности оксидазы L-аминокислот, объединяют (объем 205 мл) и концентрируют при помощи диализа до 40 ют. Удельная электропроводность полученного раствора 1,7 , 0,02 М. рН раствора доводят до 5,4 с помощью 20%-ной уксусной кислоты. Раствор фермента наносят на уравновешенную 0,02М pacTBopcffjj уксуснокислого ам 4ония (удельная электропроводность 1,7 ) колонку КМ-целлюлозы. Через колонку пропускают 0,5 л 0,02 М раствора уксуснокислого аммония, рН 5,4 (удельная электропроводность 1,7 х X . скорость элюации 45 мл/ч. Собираются фракции по 1&мп Оптическую плотность элюата регистрируют непрерывно с помощью Увикорда. Во фракциях, содержащих белки, определяют активность оксидазы L-аминокислот (субстрат - L-лейцин) объединяют их (выход 145 мл) и концентрируют при помощи диализа.

Характеристика препарата: выход 85,7%, степень очистки - 25,6 раза активность оксидазы L-аминокислот 5,4 ед/мг белка.

Пример 3. К4,9г яда добаляют 40 t/in 0,21 М раствора .уксуснокислого аммония с удельной электропроводностью 15,5 , рН 6,6. Смесь медленно перемааивают 4 ч при 4 С. Растворенный яд центрифугируют при 5000 об/мин при в течение 30 мин. Осадок выбрасывают, надосадочную жидкость используют для гель-фильтрации. На уравновешенную 0,21 М раствором уксуснокислого амгюния (удельная электропроводность 15,5 ) колонку с сефадексом G-100 сверхтонким (размеры колонки 4,2x140 см) наносят раствор яда.

Колонку элюируют 0,21 М раствором уксуснокислого аммония с удельной электропроводностью 15,5 х X , рП 6,6, со скоростью 13 мл/ч и собирают фракции по 19 мл. Оптическую плотность элюата регистрируют непрерывно с помощью

Увикорд-11. Получают 9 белковых пиков. Во. II пике фракции, которые имеют активности оксидазы L-аминокислот, объединяют (объем 200 мл) и подвергают диализу до выхода 40 мл желтого раствора белка с удельной

электропроводностью 1,8. см- . 0,021 М. Доводят рН 20%-ной уксусной кислотой до 5,5..

Раствор фермента наносят на уравновешенную 0,021 М раствором уксусно кислого амглония (удельная электропроводность1,8 ) колон,ку карбоксиметилцеллюлозы . Через Колонку пропускают 0,5 л 0,021 М раствора уксуснокислого аммония рН 5,5 (удельная электропроводность раствора 1,8 ). Скорость элюации 45 мл/ч. Собирают фракции по 15 глл. Оптическую плотность элюата регистрируют непрерывно с помощью Увикорда. Во фракциях определяют активность оксидазы .-аминокислот (субстрат - L-лейцин).. При ионообменной хроматографии на КМ-целлюлозе оксидаэа L-аминокислот проходит катионит в данных условиях, а остальные белки, имеющие изоэлект- ричегскую точку вьше 5,3, связываются на катионит. Фракции, содержащие активности оксидазы L-аминокислот, объединяют (выход 140 мл) и конденсируют при помощи диализа.

Характеристика препарата: выход 85,1%, степень очмстки - 25,2 раза,, активность оксидазы L-аминокислот 5,1 ед/мг белка.

Концентрированный раствор фермента полностью сохраняет активность в течение 24 мес при температуре хранения .

Определение активности оксидазы Ь-аминокислот.

Активность фермента оксидазы L-аминокислот определяют с L-лейцином, который окисляется под действием фермента до соответствующей (it-кетокислоты.

За единицу активности оксидазы L-аминокислот принимают количество фермента, которое окисляют 1 мкмоль

L-лейцина до oL-кетокислоты в минуту при , рН 8,5. Активность окбидазы L-,aминoкиcлoт выражают по содержанию белка в препарате, которое определяется по методу Лоури.

Технико-эконоглический эффект предлагаемого изобретения заключается вэкономии змеиного яда за счет увеличения Качества ферментного препарата (увеличение выхода, повышение

Степени очистки). Упрощается процесс очис- ки оксидазы L-аминокислот из яда гюрзы, особенно этап ионообменной хроматографии.

Оксидаза L-гlминoкиcлoт может быть использована для различных аналити710557698

ческих целей при изучении процес- также для препаративных целей - npli (сов транспорта а1 1инокислот в процессе синтезе .тироксина, чистых О-нзомесинтеза белка (инженергенетика), а РОВ аминокислот и.L-кетокислот.

СПОСОБ ВЬЩЕЛЕНИЯ ОКСИДАЗУ L-АМИНОКИСЛОТ ИЗ ЯДА ГЮРЗЫ, предусматривающий растворение яда в буферном растворе с последующим центрифугированием, гель-фильтрацию полученной надосадочной жидкости на сефадексе G-100 и зфоматографию ферментсод ержащего раствора на с ионообменной смолой с элюацией фермента солевым раствором, от л и ч а ю щ и и с я, тем, что, с целью повьшения выхода и степени очистки целевого, продукта, растворение яда и гель-фильтрацию осуществляют с иСпсльзоваки 4 в качестве буфера 0,19-0,21 М раствора уксуснокислого аммоний рН б,4-6,6,полученный после гель-фильтрации ферментсодержащий раствор подвергают перед хроматографией обессоливанию диализом до уп&пъпоК электропроводности ,