СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МОДИФИЦИРОВАННОГО КРЕМНЕЗЕМНОГО СОРБЕНТА Советский патент 1995 года по МПК B01D15/08 

Изобретение относится к химически модифицированным кремнеземным сорбентам для хроматографии и может быть использовано для разделения, концентрирования и очистки биополимеров.

Целью изобретения является повышение адсорбционной емкости и снижение необратимой сорбции по отношению к биополимерам.

Сущность изобретения заключается в следующем.

Кремнезем в выбранном количестве с известной удельной поверхностью и диаметром пор помещают в стеклянную ампулу, присоединяют к вакуумной установке. Ампулу нагревают в песчаной бане до температуры 573 К при одновременном вакуумировании до остаточного давления 10^-3 Торр и заполняют озоном из расчета 1 г на 10 г кремнезема. Систему выдерживают 5 ч при комнатной температуре, и непрореагировавший озон и летучие продукты реакции озона с кремнеземом удаляют вакуумированием при 200-400 К. После этого в систему добавляют перфтормономер (0,01-0,5 на 1 м² поверхности кремнезема), выдерживают до прекращения падения давления в системе и удаляют избыточное количество мономера любым известным способом. Ампулу откачивают до остаточного давления 10^-3 Торр и нагревают до температуры 605-620 К со скоростью 0,5-1,0 град/мин. Систему выдерживают 15-20 мин при этой температуре и охлаждают со скоростью 0,1-0,2 град/мин до комнатной температуры.

При реализации указанного способа получения сорбента образуется сплошное равномерное покрытие, макромолекулы которого прочно удерживают на поверхности кремнезема за счет химических связей. Избыточное количество озона удаляют в интервале температур от 200 до 400 К. Выбор диапазона температур удаления озона обусловлен тем, что при низкой температуре (< 200 К) озон, по-видимому, прочно сорбируется кремнеземом и плохо удаляется, что приводит при напускании тетрафторэтилена к взрыву, При высокой температуре (> >400 К) ускоряется гибель радикалов, образующихся за счет процессов взаимодействия озона и кремнезема, в результате чего не образуется сплошного полимерного покрытия, что приводит к увеличению необратимой адсорбции разделяемых веществ. В качестве перфтормономера можно использовать, например, тетрафторэтилен, гексафторпропилен, димер гексафторпропилена и другие. Количество перфтормономера менее 0,01 г/м² недостаточно для снижения необратимой сорбции разделяемых веществ. Количество перфтормономера выше 0,05 г/м² приводит к снижению адсорбционной емкости. При нагревании носителя, обработанного перфтормономером, выше температуры 620 К снижается механическая прочность полимерного покрытия, при нагревании ниже температуры 605 К время термообработки увеличивается. Время термообработки 15-20 мин выбрано исходя из известных скоростей релаксационных процессов в полимерном покрытии. Нагрев со скоростью менее 0,5 и более 1,0 град/мин, также как и охлаждение скоростью менее 0,1 и более 0,2 град/мин, приводит к неравномерности полимерного покрытия.

В соответствии с предлагаемым решением пористыми кремнеземными носителями могут являться макропористые стекла, силикагели, диатомиты с размером пор более 6 нм. Выбранные интервалы структурных характеристик пористого кремнеземного носителя являются оптимальными, так как в случае малых диаметров пор очень трудно получить равномерное полимерное покрытие.

П р и м е р 1. Получение сорбента, имеющего толщину полимерного покрытия 10 нм, 10 г макропористого стекла МПС-2000 ГХ (диаметр пор 200 нм, уд.поверхность 30 м²/г), помещают в стеклянную ампулу, присоединяют к вакуумной установке. Ампулу нагревают в песчаной бане до температуры 573 К при одновременном вакуумировании до остаточного давления 10^-3 Торр, после чего заполняют озоном (1 г). Систему выдерживают 5 ч при комнатной температуре, и непрореагировавший озон и летучие продукты реакции озона с кремнеземом удаляют вакуумированием при той же температуре. После этого в систему добавляют 4,6 г тетрафторэтилена, выдерживают до прекращения падения давления в системе и удаляют вакуумированием избыточное количество мономера. Ампулу откачивают до остаточного давления 10^-3 Торр и нагревают до температуры 620 К со скоростью 1,0 град/мин. Систему выдерживают 20 мин при той температуре и охлаждают до комнатной температуры со скоростью 0,1 град/мин. В результате такой обработки на поверхности кремнезема образуется перфторполимерная пленка толщиной около 10 мин (данные ртутной порометрии), состав которой определен методами элементарного микроанализа (мас, C 34,2; F 64,9; O 0,09). Методом ИК-спектроскопии в пленке найдены полосы поглощения, соответствующие колебаниям связей С-F (1410 см^-1).

П р и м е р 2. Получение сорбента, имеющего толщину полимерного покрытия 2 нм. Синтез ведут как в примере 1, но вместо МПС-2000 ГХ используют МПС-250 ГХ (диаметр пор 25 нм, уд.поверхность 105 м²/г), избыток озона и летучих продуктов реакции удаляют вакуумированием при температуре 200 К, а после удаления озона и летучих продуктов реакции в систему добавляют 10,8 г тетрафторэтилена. В результате такой обработки на поверхности кремнезема образуется перфторполимерная пленка толщиной около 2 нм (данные ртутной порометрии), состав которой определен методами элементарного микроанализа (мас. С 34,3; F 64.6; O 1,3) ИК-спектр сорбента такой же, как в примере 1.

П р и м е р 3. Получение сорбента, имеющего толщину полимерного покрытия 5 нм. Синтез ведут, как в примере 1, но вместо МПС-2000ГХ берут МПС-700 ГХ (диаметр пор 70 нм, уд.поверхность 70 м²/г), избыток озона и летучих продуктов реакции удаляют вакуумированием при температуре 400 К, а после удаления озона и летучих продуктов реакции в систему добавляют 9,8 г тетрафторэтилена В результате такой обработки на поверхности кремнезема образуется перфторполимерная пленка толщиной около 5 нм (данные ртутной порометрии), состав которой определен методами элементарного микроанализа (мас. C 34,8; F 64,3; O 0,9). ИК-спектр сорбента такой же, как в примере 1. На сорбентах, полученных по примерам 1-3, и сорбенте по прототипу определена необратимая сорбция нуклеиновых кислот, являющаяся важным показателем качества сорбента и равномерности полимерного покрытия.

Для определения необратимой сорбции транспортной РНК (тРНК) к 1 г сорбента, полученного по примерам 1-3, прибавляют 5 мл пропилового спирта, дегазируют под вакуумом. Затем спирт декантируют, сорбент промывают 0,01 М трис-HCl буфером (рН 7,5) и помещают в колонку размером 1 х 6 см. На колонку наносят 1 мг тРНК E.coli в 0,5 мл указанного буферного раствора и элюируют со скоростью 0,5 мл/мин общим объемом 10 мл. После этого производят смену буфера (10% пропанола в 0,01 М трис-HCl, рН 7,5). Собирают 10 мл элюата и спектрофотометрически определяют концентрацию тРНК. Умножая концентрацию на объем элюата (10 мл), получают содержание тРНК и содержанием ее в элюате представляет собой величину необратимой сорбции тРНК на сорбенте синтезированном по предлагаемому способу. Полученные результаты представлены в таблице. Для определения емкости сорбентов по тРНК 0,1 с сорбента, полученного по примерам 1-3, помещают в колонку размерами 1 х 6 см. На колонку наносят 20 мг тРНК E. coli в 10 мл трис-Hcl буфера (рН 7,5). Контроль за выходом тРНК ведут с помощью проточного спектрофотометра с длиной детектируемой волны 254 нм. После начала выхода пика его собирают в 25 мл элюата и по методике, описанной выше определяют количество сорбированной тРНК. Результаты представлены в таблице (в пересчете на 1 г сорбента).

Сорбенты, полученные по примерам 1-3, были использованы для обессоливания, концентрирования и депротеинизации тРНК,
П р и м е р 4. Синтез как в примере 1, но вместо МПС-2000ГХ берут силикагель марки МСА-750 (диаметр пор 560, нм, уд.поверхность 66 м²/г), а после удаления озона и летучих продуктов реакции в систему добавляют 6,7г тетрафторэтилена и выдерживают до прекращения падения давления в системе. Затем удаляют избыточное количество мономера путем вакуумирования, откачивают до давления 10^-3 Торр и нагревают до температуры 605 К со скоростью 0,5 град/мин. Систему выдерживают 15 мин при этой температуре и охлаждают со скоростью 0,2 град/мин до комнатной температуры. В результате такой обработки на поверхности кремнезема образуется перфторполимерная пленка толщиной около 5 нм (данные ртутной порометрии), состав которой определен методами элементарного микроанализа (мас. C 34,6; F 64,5; O 0,9). ИК-спектр сорбента такой же, как и в примере 1.

П р и м е р 5. Синтез ведут как в примере 4, но вместо силикагеля МСА-750 берут силикагель МСА-1500 (диаметр пор 1450 нм, уд.поверхность 30 м²/н), а после удаления озона и летучих продуктов реакции в систему добавляют 6,0 г тетрафторэтилена. В результате такой обработки на поверхности кремнезема образуется перфторполимерная пленка толщиной 8 нм, состав которой определен методами элементарного микроанализа (мас. С 34-2; F 64,9; O 0,9). ИК-спектр сорбента такой же, как в примере 1.

Сорбенты, полученные по примерам 4-5, использовали для отделения плазмид от РНК и белков.

П р и м е р 6. Синтез ведут как в примере 1, но вместо МПС-2000ГХ берут силикагель Армсфер Сил 6 (диаметр пор 6 нм, уд.поверхность 220 м²/г), а после удаления озона и летучих продуктов реакции в систему добавляют 24 г гексафторпропилена. В результате такой обработки на поверхности кремнезема образуется перфторполимерная пленка толщиной около 2 нм (данные ртутной порометрии), состав которой определен методами элементного микроанализа (мас. C 34,6; F 63,9; O 1,5), ИК-спектр сорбента такой же, как в примере 1.

П р и м е р 7. Синтез ведут как в примере 1, но вместо МПС-2000ГХ берут силикагель Армсфер Сил 30 (диаметр пор 28 нм, уд.поверхность 80 м²/г), а после удаления озона и летучих продуктов реакции в систему добавляют 8,6 г димера гексафторпропилена (ДГФП). В результате такой обработки на поверхности кремнезема образуется перфторполимерная пленка толщиной около 2 нм (данные ртутной порометрии), состав которой определен методами элементного микроанализа (мас. C 34,6; F 64.6; O 1,0). ИК-спектр сорбента такой же, как в примере 1.

Сорбенты, полученные по примерам 6-7, используют для обращенно-фазовой хроматографии пептидов, олигонуклеотидов, белков, витаминов и других биологически активных веществ.

П р и м е р 8. Синтез ведут как в примере 1, но вместо ПС-2000ГХ берут диатомит (диаметр пор 800 нм, уд.поверхность 2 м²/г), а после удаления озона и летучих продуктов реакции в систему добавляют 1,1 г тетрафторэтилена. В результате такой обработки на поверхности кремнезема образуется перфторполимерная пленка толщиной около 10 нм (данные ртутной порометрии), состав которой определен методами элементного микроанализа (мас. F 64,0; C 64,8; O 0,8). ИК-спектр сорбента такой же, как в примере 1. Сорбент, полученный по примеру 8, можно использовать как носитель для газовой хроматографии.

П р и м е р 9. Проводят концентрирование, обессоливание и депротеинизацию тРНК, используя 2 г сорбента, приготовленного в соответствии с примерами 1-3 по следующей схеме: cначала приводят колонку в состояние равновесия с 0,01 м трис-HCl буфером (рН 7,5) по методике, описанной в примере 3. Затем прокачивают 100 мг солевого раствора тРНК, загрязненной примесями белков. При этом тРНК количественно сорбируется на колонке, а соли вымываются исходным буфером. После полного обессоливания (контроль ведут по электропроводности элюата) адсорбированная тРНК вымывается 10%-ным раствором пропанола в исходном буфере в объеме 5 мл. Таким образом, одновременно происходит депротеинизация тРНК и ее концентрирование в 20 раз за 4,0 мин. Колонку можно регенерировать градиентом концентрации (от 0 до 50%) ацетонитрила общим объемом элюента 100 мл со скоростью 200 мл/ч, после чего ее можно использовать повторно.

Пример использования сорбентов, полученных по примерам 4-5, для выделения плазмид.

П р и м е р 10. Проводят очистку плазмид от РНК и белков. На колонку, содержащую 2 г сорбента, полученного по примерам 4-5 и уравновешенную 0,01 м трис-НCl буфером (рН 7,5) по методике, описанной в примере 3, наносят 5 мл осветленного лизата плазмиды pBR (60 мг). Плазмида элюатируется исходным буфером со скоростью 100 мл/ч. Собирают фракцию объемом 25 мл с момента начала выхода пика. При этом РНК и белки остаются на колонке. Ее можно регенировать по методике, описанной в примере 9. Продолжительность всего цикла составляет около 1 ч, после чего можно сразу начать новый.

Примеры использования сорбентов, полученных по примерам 6-7.

П р и м е р 11. Проводят разделение пептидов на колонке (2 х 65 мм), заполненной сорбентом, полученным по примерам 4-5. Элюацию ведут градиентом концентраций (0-50%) ацетонитрила в 1%-ной трифторуксусной кислоте общим объемом элюента 2400 мкл. Порядок выхода пептидов: А-цепь инсулина, Брадикинин, В-цепь инсулина, лизоцим, наивный инсулин (свиной).

П р и м е р 12. Проводят разделение жирорастворимых витаминов на колонке (2 х 65 мм), заполненной сорбентом, полученным по примерам 6-7. Элюацию ведут ступенчатым градиентом концентраций (40-100%) ацетонитрила (рН 8,0) со скоростью 100 мкл/мин общим объемом 2400 мкл. Порядок выхода витаминов" витамин А, витамин Е, витамин К.

Изобретение относится к химически модифицированным кремнеземным сорбентам для хроматографии и позволяет повысить адсорбционную емкость и снизить необратимую сорбцию биополимеров. Кремнезем вакуумируют в ампуле при 573 К и 10^-3 Торр и напускают озон из расчета 1 г на 10 г кремнезема. Выдерживают при комнатной температуре 5 ч и удаляют летучие продукты при 200 400 К под вакуумом. Добавляют перфтормономер (тетрафторэтилен, гексафторпропилен или его димер) из расчета 0,01-0,05 г/м² поверхности носителя. Выдерживают до прекращения падения давления в системе и удаляют избыток мономера. Ампулу вакуумируют до 10^-3 Торр и нагревают до 605 620 К со скоростью 0,5 1,0 град/мин. Выдерживают при 605 620 К 15 20 мин и охлаждают до комнатной температуры со скоростью 0,1 0,2 град/мин. 1 табл.

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МОДИФИЦИРОВАННОГО КРЕМНЕЗЕМНОГО СОРБЕНТА, включающий активацию пористого кремнеземного носителя и обработку перфтормономером, отличающийся тем, что, с целью повышения адсорбционной емкости и снижения необратимой сорбции по отношению к биополимерам, активацию осуществляют озоном с последующим удалением летучих продуктов реакции озона с кремнеземом и избытка озона при температуре 200 400 К, обработку перфтормономером ведут из расчета 0,01 0,05 г на 1 м² поверхности кремнезема с последующим удалением непрореагировавшего мономера, и обработанный кремнезем нагревают со скоростью 0,5 1,0 град/мин до температуры 605 620 К, выдерживают 15 20 мин и охлаждают со скоростью 0,1 0,2 град/мин до комнатной температуры.