Способ приготовления сорбента" Советский патент 1980 года по МПК C12K7/00 C01B33/00 

шем анализируют на содержание вируса и примесей бе,лка.,

Пример 1. К 60 см .макропористого стекла (МПС-1000) прибавляют 60 мл 1 -10%-кого раствора гамма-аминопропилтриэтоксисилана в ацетоне, хорошо перемешивая, высушивают на воздухе, а затем в сушильном шкафу при 110° С в течение 6 ч. Концентрацию аминогрупп на поверхности такого стекла определяют в пределах 0,1 -1,2 мг зкв/г. К обработанному таким образом стеклу прибавляют 90 мл 0,25 М фосфатного буфера (рН 7,0) и 10 мл 25%ного водного раствора глутарового альдегида и перемешивают 1 ч при комнатной температуре. К промытому водой стеклу прибавляют 100 мл 1 М трис-НС буфера {рН 7,0), полученную суспензию перемешивают 2 ч, промывают водой и загружают в хро.матографическую колонку (0,9X14 см). После заполнения сорбентом колонку уравновешивают элюируюш;им буфером. Элюентом может служить 0,05-0,1 М фосфатносолевой буфер с содержанием 0,1-0,2 М хлористого натрия.(рН 7,,0) или 0,05- 0,1 М трис-буфер с 0,15 yW хлористого натрия (рН 7,5-8,0). Скорость элюции можно изменять в пределах 0,1-4,0 см/мин. Культуральную жидкость, содержащую вирус клеш,евого энцефалита (шт. «Софьин ИЛ(И «Пан) или суспензию вируса гриппа (шт. МРЦ 11) Объемом 0,2-1,0 мл вводят в колонку и элюируют буфером, которым колонка уравновешена. В 4-м-5-м мл элюата выходит очищенный вирус. Белковые примеси выходят из колонки- в 8-м- 10-м мл злюата и не содержат практически вирусной активности. Выход вируса из колонки зависит от концентрации групп трис(-оксиметил-)аминометана на поверхности кремнезема. И в оптимальном случае (0,3- 0,4 мг экв/г) выход как вируса клещевого энцефалита, так и вируса гриппа составлял 90-100% от вирусной активности, введенной в колонку.

Пример 2. К 25 мл силох рома С-80, обработанного предварительно растворами гамма-аминотриэтоксисилана и глутарового альдегида, как описано в примере 1, приливают 25 мл I М трис-НС1 буфера (рН 6,85) и перемешивают в качалке 2 ч при комнатной температуре. После отмывки дистиллированной водой полученный .сорбент уравновешивают в элюирующем буфере и загружают в колонку (0,8X12,0 см). В эту колонку вводят 0,5-1,0 мл суспензии вируса клещевого энцефалита или вируса гр.иппа и проводят элюцию. Элюентом являются буферные растворы, приведенные в примере 1. В 3-м-4-м мл элюата выходит 100% вирусной активности, внесенной в колонку. Примесные белки и низкомолекулярные вещества элюируются в 7-м и 8-м мл

ci щ/ло-уа

Пример 3. Макропористое стекло (МПС-1000), модифицированное трис(-оксиметил-)а:минометаном с содержанием на поверхности модификатора 0,4 мг экв/г,

подвергают последующему восстановлению, которое проводят следующим образом.

К высушенному модифицированному, как описано в примере 1, стеклу добавляют 60 мл дистиллированной воды и 60 мл

0,1%-ного раствора NaBH4 и в течение 30 мин интенсивно перемещивают. Затем обработанное таким образом стекло отмывают дистиллированной водой, уравновещивают элюирзющим буфером и загружают в

колонку (0,8X12,0 см). Через колонку пропускают суспензию с активным йли инактивированным формалином вирусов клещевого энцефалита объемом 0,5-1,0мл. Условия элюирования аналогичны условиям, приведенным в вышеописанных примерах. Выход как активного, так и йнактивированного вируса из колонки составляет 100%.

.Модификация макропористых кремреземов 7р«с(-оксиметил-) аминометаном делает

возможным их использование для гельфильтрационной хроматографии вирусных суспейзий. Такой способ приготовления сорбента устраняет адсорбцию вирусных частиц на поверхности макропористого кремнезема и позволяет производить без потерь очистку вирусного материала.

Использование в качестве модификатора т;7мс(-оксиметил-) аминометана не вызывает загрязнения очищаемых вирусных препаратон биологическ;и активными молекулами, так как он не является биологически активным веществом (он входит,в состав кровезамеНителя).

Данный способ получения сорбента технологически несложен. Полученный сорбент отличается постоянством свойств и долговечностью за счет химического связывания . молекул триса с поверхностью стекла. Модифицированный трис (-оксиметил-)

аминометаном кремнезем не подвержен воздействию различных ферментов, содержащихся в суспензиях вирусов. Это расширяет возможности применения сорбента, полученного данным способом, в частности, делает его пригодным для применения в хроматографии различных ферментов.

Формула изобретения

Способ приготовления сорбента для очистки вирусных суспензий путем последовательной обработки поверхности макропористого кр емнезема модификаторами с последующим промыванием сорбента и уравновешиванием буфером, отличающийс я тем, что, с целью предзпреждёния попадания в вирусный npenaipaT молекул биологически активного модификатора и повышения устойчивости сорбента к фермен5пористого кремнезема модифицируют последовательной обработкой 1-Ш /о-ньшраствором гамма-аминопропилтриэтоксисилана и 1-5 %-ным раствором глутарового альдегида, затем полученный сорбент про-5 мывают дистилли|рованной водой и влажный сорбент смешивают в равных колнчебствах с 0,5-1,5 М раствором грыс(-оксиметил-)аминометана. Источник информации, принятый во внимание при экспертизе: 1. Сборник трудов ИП и ВЭ, М., 1972, с. 18-19.