Способ получения сорбента для очистки вирусных суспензий Советский патент 1984 года по МПК B01J20/10 C12N7/02 

СО

о а

Изобретение относится к способу получения сорбента для очистки вирусных суспензий и может быть использовано при производстве вирусных антигенов и вакцин.

Известен способ получения сорбента для очис 5 тки вирусных сзп:пензкй, включающий многократную обработку макропористого кремнезема раствором поливинилпирролидона с последующей ермообработкой в течение 24 ч 1.

Однако известный способ длителен. Недос- )0 таточная стабильность получаемого сорбента, бусловленная непро шоЙ связью кремнезема, риводит к эагрязне}Шю вирусной суспензии одифицирующим агентом.

Наиболее близкшл к оредпагаемому по тех- tS нической сущности и достигаемому результату вляется способ получения сорбента njrreM поледовательной обработки стеклаJf -аминотризтоксисиланом и смесью нитрита натрия и сояной кислоты {2J.20

Получаемый сорбент с оксипропильш.1ми руппами сорбирует Не только примесные белки из очищаемой вирусной суспензии, но и вирус-: ttbie частицы, что пршодит к снижению выходов вируса.25

Цель изобретения - снижение сорбционной способности к вирусам.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения сорбента для очистки BHpyctox суспензий, включающему обработку зо кремиеземсодержащего материала -аминопро ; шштриэтоксисиланом и натрия в присутствии кислоты, после обработки смесью BMTpHta натрия и кислоты кремнеземсодержащий материал подвергают взаимодействию с N-виаилпирролидоном или его водным раствором в присутствии соляной кислоты.

Используют водньш раствор N-винилпнрролидона с концентрацией не ниже 30%.;

Кремнеземсодержащий материал с оксипроцильными группами может быть также получен путем обработки оксипропилсиланом в виде триметилсилилового зфира или в виде эфуфя Зяссусной кислоты с последующим удалением защитной групш.1.

Пример 1. К 50 мл стекла МПС-. 2000 В прибавляют 50 мл 5%-ного раствора, j -аминопрошштриэтоксисилана в ацетоне, перемешивают и выдерживают при 100 течение 6 ч. К модифицированному стеклу при-50 швают 100 мл 0,1 н. раствора соляной кислоты и порциями в течение 0,5 ч прибавляют раствор 2 г шприха натрия в 10 мл воды, перемешивают) еще 2 ч и промьюают водой. Количество оксипропильных групп, определенное по разности 55 исходных и не вступивщнх в реакцию аминоTpymt, составляет 0,4 мг-зкв/г. Не вступившие в реакщю аминогруппы отсутствуют.

К, 30 мл модифицированного стркла МПС-2000 В добавляют 30 мл Ы-винилпирролидона и 0,1 мл концентрированной соляной кислоты, перемешивают 2 ч, промывают водой, раствором бикарбоната натрия и снова водой. Контроль отмывания модифицированного сорбента от не вступивщего в реакцию N-виншширролидона вед}гг по отсутствию поглощения при 230 нм. Модифицированное стекло высутпивают на воздухе при бСРС. Содержание азота 0,59%. В ИК-спектре имеется интенсивная пОлоса поглощения при 1650 см (CO-MR).

Полученный сорбент вносят в хроматогрэфическую колонку размером 1 х 10 см, которую уравновешивают М г/шс-НС1 буфером с рН 7,8. В колонку вводят 1 мл алантоисной жидкости, содержащей вирус гриппа А j Техас, и проводят элюирование буфером, подавая его со скоростью 2 МЛ/МИНслг. На выходе колонки собирают фраквдй объемом 1 мл.

В 4 и 5-и фракциях злюата собирают 90% ощаденного вируса гриппа, примесные белки и низкомолекулярные вещества злюируются в 6-8-и фракциях элюата. Содержаний примесного белка в очищенной суспензии В1фуса гриппа составляет 0,01 мл/мл (в исходной алантоисной жидкости 2,5 мг/мл), степень очистки 99,6%. Потери вирусного материала отсутствуют,

Аналогично проводят ошстку вируса группы А/Виктория/72. Выход вируса 90%, степень очистки от примесных белков 99,2%..

Испытания модиф Ицированного носителя показывают, что выход вируса гршша при очистке не зависит от щтамма.

При использовании оксипропилстекла МПС-2000В в аналогичных условиях сорбируемоста вируса гриппа достигает 95%, соответственно шыход вирЗса 5%, Последаоощее промывание колонки 0,1 М Tpuc-UCl буфером с рН 8,6, содержащим 0,5 М MaCJj приводит к десорбции 40% внесенного в колонку вируса. Потери вирусного материала 55%,

Пример 2. При модафицировашга стекла МПС-1000 В в условиях примера 1 получают стекло с содержанием оксипропильных групп 0,26 мг-экв/г.

К 10 мл стекла МПС-1000 В с содержанием оксипропильных групп 0,26 мг экв/г добавляют 20 мл 50%-ного водного растбора М -винилпирролидона и 0,2 мл концентрированной соляной кислоты и дайее обработку ведут аналогично примеру 1. Получааот сорбент с содержанием азота 0,4%, который используют для выделе1шя вируса клещевого знцефзжПа из культуральвой суспензии. Для этого колонку 0,8x12 см, заполненную полученньпл сорбентом, уравновешивают 0,1 М к ipuc-HCl буфером с рН 8,0. В нее вводят 1 мл трусво& суспензии и злюируют указанным ,, скорость злюирова3107ния 2 мл/мин см. В 3 и 4-и фракциях элюата собирают вирус, в 6-8-й фракхщях элюируются вирусные белки. Выход вируса из колонки 95%. Содержание примесного белка в очищенном препарате вируса клещевого энцефалита 0,007 мг/мл (в исходаой суспензии 1,1 мг/мл) степень очистки 99,6%. При использовании оксняропилстекла в анала; гичных условиях сорбирусмость вирусз клещево4 Го энцефалита 50%. Соответственно выход очи- , щенного вируса состгшляет половину ot внесен.ного в колонку более жестких условиях (при использовании для эяюйрования вируса 0,1 М трис -ИС буфера с рН 8,5, содержащего Oi5 М NaCl ) десорбащя вируса не наблюдается. 1 Пример 3. К 50 мл силохрома С-80 прибавляют 50 мл 7%-ного раствора гс -аминопрогои1триэток(Лнсйлана в ацетоне и далее процесс ведут как в примере 1, количество оксш1ропильиь1Х групп 0,49 мг-экв/г.2 К, 30 мл модифицированного силохрома С-80 добавляют 60 мл 30%-ного раствора N-jзиншI6пирролидона и 0,2 мл концентрированной соляной кислоты, далее обработку ведут анало гично примеру 1. Получают сорбент с содержанием азота 0,7%, которым загр окают колонку размером 0,8x12 см. Колонку уравновешивают 0,1 М фосфатньпл буфером с рН 8,0 и вводят в нее 1 мл инактивированной суспензии вируса клещевого жцефалита (иммуногенность 27 ед. ПР . концентрация белка 870 мкг/мл). Вирус элюирует фосфатным буфером, KOTOpbnti колонка уравновешена, элюат собирают во фракции объемом 1 мл. В 3 и 4-й фракциях элюата собирают очищенный вирус (23 ед. И , концентрация белка 6 мкг/мл). В 6-8-й фракциях элюируются примесные белки. Выход вируса из колонки 85%, степень очистки от белков 99,2%. Таким образом, сорбент, получешп.1Й предложенным способом, позволяет проводить эффективную очистку вирусных суспензий без потерь вирусного материала с высокой степенью очистки от примесных белков .

1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СОРБЕНТА ДЛЯ ОЧИСТКИ ВИРУСНЫХ СУСПЕНЗИЙ, вклю-1 чающий обработку кремнеземсодержащего материала - змишпрошиприэтоксиашаном и нитри- том натрия в присутствии кислоты, о т л и ч a ю щ ии с я тем, что, с целью снижения сорбционной способности к вирусам, после обработки смесью нитрита натрия и кислоты, кремнеземсодержгщий А/ териал подвергают взаимодействию с N-винилпирролидоном или его водным раствором в присутствии соляной кислоты. ; 2. Способ по п. 1, о т л и ч a ю щ и и с я тем, что используют водный раствор N-винилаирролидона с концентрацией яе ниже 30%.