ШТАММ БАКТЕРИЙ AEROMONAS SOBRIA - ПРОДУЦЕНТ ПРОТЕКТИВНОГО АНТИГЕНА Советский патент 1996 года по МПК C12N1/20 A61K39/02 

Изобретение относится к микробиологии и представляет собой новый вирулентный штамм аэромонад, используемый как продуцент протективного антигена.

Целью изобретения является выделение штамма Aeromonas sobria, носителя факторов вирулентности и продуцент протективного антигена.

Штамм A.sobria 77-18 выделен из паренхиматозных органов белого толстолобика с клиническими признаками заболевания.

Выделенный штамм A.sobria депонирован в коллекции микроорганизмов ВГНКИ с регистрационным номером КРК 1-1983 ДЕП.

Штамм Aeromonas sobria 77-18 характеризуется следующими свойствами.

Морфологические и культуральные свойства. Вегетативные клетки. При культивировании на эритрит-агаре при температуре 25-26^оС бактерии палочковидной формы, концы закругленные, грамотрицательные, некислотоустойчивые. Спор и цист не образуют.

Характеристика колоний на плотной среде. На эритрит-агаре через 18-20 ч колонии размером 1-1,5 мм, круглые, выпуклые с ровным краем. Консистенция вязкая, S-форма, кремовато-белые, полупрозрачные.

На среде Риппея-Кабелли через 18-20 ч аналогичные колонии желто-оранжевого цвета.

На мясопептонном бульоне при тех же условиях культивирования равномерное помутнение среды, нежная, тонкая пленка.

Физиологические и биохимические свойства.Хемогетеротрофы, используют в качестве источника углерода различные сахара и органические кислоты. Факультативный анаэроб.

Сбраживает до кислоты и газа: маннит, сахарозу, мальтозу, галактозу, трегалозу, рибозу, фруктозу. Не усваивает рамнозу, салицин, сорбит, дульцит, ксилозу, адонит, раффинозу, целлобиозу, мелицитозу, d- и l-арабинозу, инозит,инулин, сорбозу, образует газ на среде с глюкозой и глицерином, замедленно сбраживает лактозу, растет на цитратной среде Симмонса, не растет на среде с мочевиной по Христенсену, вызывает редукцию нитратов, в реакции Фогеса-Проскауэра и с метиленовым красным отрицательный, резистентный к вибриостатическому агенту 0/129.

Гидролизует желатин, крахмал, казеин, твины 20,21,40,60,65,80 и 85. Не растет на среде с цианистым калием, не обладает гиалуронидазой и плазмокоагулазой, обладает β-гемолизином, бутандиолдегид- рогеназой, β-галактозидазой, фенилаланиндезаминазой, дезоксирибонуклеазой (ДНКазой), образует индол.

В составе цитоплазматических белков штамма методом электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия выявлено до 40 белковых компонентов. На фракцию с молекулярной массой 57±2 кДа приходится от 17% и выше от суммы белков на электрофореграмме. Концентрация этого белка у авирулентного штамма менее 10% от общей суммы белков.

Ферментный состав. Отличительная особенность протеолитическая активность в широком диапазоне рН (4,0-0,9) с максимумом в нейтральной зоне (7,0-7,2). Протеолитическая активность непатогенного штамма 78-16 проявляется в узкой зоне значений рН (7,1-7,6). Активность нейтральной протеиназы в 3,5 раза выше таковой у авирулентного штамма.

Жирнокислотный состав. Методом газожидкостной хроматографии установлено, что в липидах штамма уровень жирных кислот с нечетным числом атомов углерода в 2-7 раз выше, чем у штамма 78-16, при этом содержание кислот с 17 углеродными атомами не менее 8% от суммы всех жирных кислот. Указанная закономерность сохраняется независимо от среды выращивания микроорганизма.

Штамм 77-18 (КРК 11-1983-ДЕП) обладает вирулентными свойствами. ЛД₅₀ 9,55х10⁷. Вызывает 100%-ную гибель рыбы при внутримышечном введении в течение 3-4 ч без развития клинических признаков. С данным штаммом впервые получена положительная биопроба контактным способом.

П р и м е р 1. Бактериальную культуру выращивают на матрасах с эритрит-агаром, затем бакмассу центрифугируют при 1500g в течение 1 ч. Супернатант сливают, осадок промывают физиологическим раствором и центрифугируют при тех же условиях. К полученному после центрифугирования осадку добавляют охлажденный до -20^оС ацетон в соотношении не менее 1:5 по объему и оставляют на 1 ч на холоде (-20^оС), периодически помешивая. Затем смесь центрифугируют 10 мин при 1000g, сливают ацетон и к осадку добавляют порцию чистого ацетона в прежнем соотношении и оставляют на 30 мин при периодическом перемешивании. После этого смесь центрифугируют при 1000g 10 мин. Ацетон сливают, осадок высушивают на воздухе при комнатной температуре до полного исчезновения запаха ацетона при постоянном перемешивании, чтобы исключить образование комков. Полученный порошок имеет светло-коричневый цвет и специфический запах. Ацетоновый порошок хранится при комнатной температуре в закрытой посуде до использования без потери биологических свойств.

Навеску ацетонового порошка (10 г) разбавляют 0,1 М трис-НСl буфером (рН 7,2), содержащим 0,2 М KCl в соотношении 1:5 и гомогенизируют в стеклянном гомогенизаторе Поттера-Эльвейма с тефлоновым пестиком 3 мин при 2000 об/мин. Гомогенат подвергают ультразвуковой обработке при 22 кГц 3 раза по 30 с с минутным интервалом на ультразвуковом диспергаторе УЗДН-2Т. Далее гомогенат центрифугируют при 105000g 1 ч. Супернатант, содержащий цитоплазматические белки микроорганизма, наносят на колонку К26/100, заполненную сефадексом Г-100 и элюируют со скоростью 50 мл/ч трис-НСl буфером (рН 7,2), содержащим 0,2 М KCl. Выходящие из колонки фракции регистрируют на абсорбциометре при 280 нм и собирают в коллектор фракций. Фракцию 2, имевшую молекулярную массу 60 кДа, отбирают и концентрируют до объема 0,5 мл методом ультрафильтрации на мембранных фильтрах Амикон У10. Сконцентрированный таким образом белок подвергают лиофильной сушке. Полученный препарат используют в качестве антигена, обладающего протективными свойствами против гомологичного и гетерологичного штаммов аэромонад.

П р и м е р 2. Проверяют протективные свойства белковой фракции по отношению к гомологичному штамму аэромонад. Для этого двухлеткам карпа внутрибрюшинно вводят до 50 и 70 мкг фракции 2. Фракцию растворяют соответственно в 0,5 и 0,7 мл раствора Хенкса и добавляют равное количество адъюванта Фрейнда. Контролем служат карпы, которым вводят стерильный раствор Хенкса. Рыба содержится в аквариумах при 20-21,5^оС при постоянной проточности, аэрации и двухразовом кормлении. Через 15 дней всех карпов заражают смывом суточной агаровой культуры 77-18.

На вторые сутки после заражения на месте инъекции у всех рыб образуется припухлость, более выраженная у рыб контрольной группы. После прорыва припухлости через 30 дней у всех рыб началась эпителизация. Результаты опыта представлены в табл.1.

Данные опыта свидетельствуют о том, что 15 дней после иммунизации срок недостаточный для протективной защиты при дозе введения антигена 50 мкг.

П р и м е р 3. Проверяют протективные свойства белковых фракций 1-4 по отношению к гомологичному штамму 77-18. Для этого по 100 мкг каждой фракции, полученной после дополнительной электрофоретической разгонки фракции 2, вводят двухлеткам карпа внутрибрюшинно. Через 30 дней карпов опытной и контрольной групп заражают внутримышечным введением смыва суточной агаровой культуры 77-18. На вторые сутки после заражения отмечают обширные припухлости с гиперемией вокруг у рыб контрольной группы, на третьи у рыб опытных групп, вакцинированных фракциями 1,3 и 4, на четвертые у вакцинированных фракцией 2, причем у последних припухлости менее выражены. На 4-5 сутки отмечают гибель рыбы контрольной группы. Результаты опыта представлены в табл. 2.

Таким образом, из 4 проверенных фракций большей протективной активностью обладала фракция 2. Припухлости и изъязвления были менее выражены, развивались с задержкой, погибло меньшее количество рыбы, pубцевание началось в более ранние сроки.

П р и м е р 4. Проверяют протективные свойства белковой фракции 2 против гетерологичных штаммов аэромонад 404 и 145-103 экс. Для этого 40 двухлеткам карпа инъецируют по 100 мкг фракции 2 в изотоническом растворе хлорида натрия. 20 контрольным карпам внутрибрюшинно инъецируют стерильный физиологический раствор. Через 40 дней всех карпов внутримышечно заражают 1,5-суточной культурой штаммов 404 и 145-103 экс. Результаты опыта представлены в табл.3.

Результаты табл.3 показывают, что в каждом опыте погибло по 3 контрольных рыбы. У карпов, вакцинированных фракцией 2, отмечают незначительные клинические признаки, которые через 2 недели практически исчезают, что подтверждает протективное действие фракции 2 против гетерологичных штаммов аэромонад.

П р и м е р 5. Проверяют протективные свойства фракции 2 против гомологичного штамма 77-18. Для этого 60 двухлеткам карпа инъецируют по 100 мкг фракции 2 в изотоническом растворе хлорида натрия, 20 контрольным карпам вводят стерильный раствор. Через 25 дней опытных и контрольных рыб заражают двухсуточной бульонной культурой штамма 77-18 (по 0,2 мл). Через 2-3 дня отмечают гибель всей контрольной группы с развитием клинических признаков. У опытной группы клинические признаки не проявляются, вся рыба остается живой, что свидетельствует об активной протективной защите фракции 2 от развития септицемии, вызываемой аэромонадами.

Изобретение относится к биотехнологии и может найти применение при получении диагностических и профилактических препаратов против болезней рыб, вызываемых аэромонадами. Целью изобретения является получение штамма Aeromonas Sobria - носителя факторов вирулентности и продуцента проективного антигена. Штамм Aeromonas Sobria депонирован в коллекции микроорганизмов ВГНКИ с регистрационным номером КРК 1-1983 ДЕП. Из бактериальных клеток выделяют протективный антиген путем обработки ацетоном. Полученный антиген в составе вакцины защищает рыбу от заражения гомологичными и гетерологичными патогенными штаммами аэромонад. Антиген не вызывает побочных отрицательных воздействий на рыбу. 3 табл.

Штамм бактерий Aeromonas Sobria ВГНКИ КРК 1-1983 ДЕП продуцент протективного антигена.