СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ БРУЦЕЛЛЕЗА Российский патент 1996 года по МПК A61K39/10 

Изобретение относится к ветеринарной и медицинской микробиологии, в частности к способам получения вакцин, применяемых для профилактики бруцеллеза.

Известен способ получения вакцины против бруцеллеза, включающий культивирование штамма Brucella abortus 19 на плотной питательной среде с последующим смывом бактериальной массы, лиофильным высушиванием микробных клеток.

Однако вакцина, полученная известным способом, имеет следующие недостатки:
является живой, в результате чего развивается бактерионосительство;
экологически небезопасна в связи с возможностью реверсий штамма;
абортогенна;
вызывает образованные антител в высоких титрах, что создает трудности при диагностике бруцеллеза.

Известен также способ получения вакцины против бруцеллеза, включающий культивирование штамма Brucella abottus 54 с последующей экстракцией антигена бруцелл, очищением на колонках с сефадексом G75, конъюгированием с водорастворимыми производными диальдегиддекстрана, модифицированными грамицидином, с использованием для конъюгации карбодиимида и дополнительной очистки полученного конъюгата. Получают в результате иммуногенную вакцину, защищающую до 89% животных, зараженных вирулентными штаммами бруцелл, и не вызывающую образования антител.

Однако этот способ имеет следующие недостатки:
вакцина, полученная известным способом, обладает недостаточно длительными протективными свойствами;
используемый штамм Brucella abortus 54 является высоко вирулентным, что создает высокую биологическую опасность при производстве вакцины;
способ получения вакцины представляет собой сложный многоэтапный процесс.

Целью изобретения является создание длительного протективного иммунитета, биологической безопасности производства вакцины и упрощение способа.

Это достигается использованием в качестве носителя целлюлозной матрицы и ее конъюгации в присутствии треххлористого хрома с белками антигена, приготовленного из вакцинного штамма бруцелл.

П р и м е р 1. Целлюлозную матрицу готовят по методу Лехтцинд Е.В. и Гурвича А. Е. 1981. Для этого хлопковую вату растворяют в медно-аммиачном комплексе (реактив Швейцера) и добавляют серную кислоту, в результате чего целлюлоза выпадает в виде мелкодисперсной взвеси.

Растворимый бруцеллезный антиген получают по методу Kaneene et al, 1978, для чего смывают с матрасов двухсуточную культуру вакционного штамма Brucella abortus 19, 50 г сырой массы бруцелл ресуспендируют в 200 мл дистиллированной воды, встряхивают в течение 2 ч, смесь автоклавируют 20 мин при 121^оС и после охлаждения центрифугируют при 12 тыс. об/мин в течение 30 мин. Надосадочную жидкость очищают на колонке с сефелексом G25 в физиологическом растворе. Белковый пик, выходящий в объеме колонки, собирают и смешивают с целлюлозной матрицей в соотношении 100 мг белка на 1 г целлюлозы при одновременном добавлении 25 мМ раствора CrCl₃. Оставляют на магнитной мешалке на холоду на 1-3 сут. Отмывают физиологическим раствором. Определяют присоединившийся белок по окрашиванию бромфеноловым синим.

Полученная белково-целлюлозная вакцина (БЦВ) представляет собой мелкодисперсную водную суспензию белого цвета.

П р и м е р 2. Для изучения клеточного иммунитета, индуцированного вакциной, определяют реакцию гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ). Мышам BaLb/c подкожно вводят разные дозы вакцины однократно или трехкратно с недельным интервалом. В контроле используют мышей того же привоза, не вакцинированных БЦВ. Через месяц животным вводят в правую лапку разрешающую дозу растворимого антигена (10 мкг белка в 50 мкл физиологического раствора), а в левую лапку 50 мкл физиологического раствора. Уровень ГЗТ оценивают через 24 ч по разнице между толщиной опытной и контрольной лапки. Полученные результаты, представленные в табл. 1, показывают, что БЦВ при всех использованных дозах и режимах ее введения, индуцирует достоверную реакцию ГЗТ.

П р и м е р 3.Для исследования протективных свойств БЦВ в сравнении с исходным растворимым антигеном, а также для изучения неспецифического действия на эти свойства целлюлозной матрицы беспородным белым мышам подкожно вводили разные дозы БЦВ. В контроле мышам вводили исходный растворимый антиген бруцелл в тех же дозах или целлюлозную матрицу без антигена. Через месяц после инъекции мышам внутрибрюшинно вводили 10³ микробных клеток бруцелл вирулентного штамма 54. Через 1 месяц после заражения проводили бактериологические и серологические исследования. При бактериологических исследованиях делали посев из органов мыши на пробирки со скошенным мясопептонным печеночным глюкозоглицериновым агаром. Через месяц проводили окончательный учет посевов и расчет индекса инфицированности по формуле
ИИ где а количество выделенных культур;
Ь количество исследованных органов. Кроме индекса инфицированности (ИИ) одновременно определяли количество микробных клеток на селезенку (селезеночное число) с помощью бактериологических посевов 10-крытных разведений гомогената селезенки. Уровень антителообразования в момент забоя животных определяли реакцией непрямой гемагглютинации.

Из данных, приведенных в табл. 2, следует, что БЦВ вызывает снижение индекса инфицированности во всех случаях по сравнению с соответствующей дозой исходного антигена и контролем заражения. Дозы антигена в 25 и 50 мкг белка достоверно (Р < <0,05) снижают накопление бруцелл в селезенках мышей с 7,7±0,65 lg м.к. (микробных клеток) в контрольной группе до 4,7±0,99 lg м.к. в группе с 50 мкг белка антигена и до 5,0±0,68 lg м.к. в группе, получившей 25 мкг белка. Конъюгация на целлюлозной матрице усиливает этот эффект антигена, достоверность различий показателя селезеночного числа между группами мышей с 25 и 50 мкг белка в БЦВ и контролем заражения возрастает (Р < <0,01). Целлюлозная матрица сама по себе не оказывает защитного эффекта против бруцеллеза. У зараженных мышей, вакцинированных БЦВ, уровень антителообразования был минимальным.

П р и м е р 4. Для исследования протективного эффекта БЦВ в сравнении с живой вакциной в динамике мышей BaLb/c иммунизировали 50 мкг БЦВ, а в контроле 10⁴ м.к. вакцинного штамма 19. Через 1 и 2 месяца после введения вакцин мышей заражали внутрибрюшинно бруцеллами вирулентного штамма 54 в дозе 10³ м. к. Через месяц после заражения проводили бактериологические исследования. Учет осуществляли также, как в примере 3. Из данных, представленных в табл. 3, следует, что протективный эффект БЦВ через 1 месяц после вакцинации сравним с таковым для живой вакцины, а через 2 месяца после вакцинации высоко достоверно (P < 0,001) превышает защитный эффект живой вакцины, оцениваемый по селезеночному числу.

Таким образом, использование целлюлозного носителя в БЦВ позволяет не только индуцировать выраженный протективный эффект против бруцеллеза, но и создавать депо иммобилизованного антигена, в результате чего защитные свойства БЦВ возрастают со временем.

П р и м е р 5. Протективный эффект БЦВ был исследован также у морских свинок, которым подкожно однократно вводили 125 мкг БЦВ. Контрольным животным вводили 10⁹ м.к. живой вакцины штамма 19. Через 1 месяц после вакцинации животных заражали 10² м.к. бруцелл вирулентного штамма 54. Кровь забирали в динамике через 2 недели, 1,2, 3 месяца и исследовали в реакциях агглютинации (РА), связывания комплемента (РСК) и непрямой гемагглютинации (РНГА). Бактериологические исследования проводили, как в примере 3.

Данные табл. 4 показывают, что число зараженных животных, индекс инфицированности и селезеночное число у морских свинок, вакцинированных БЦВ, несколько ниже, чем у вакцинированных живой вакциной.

В опытных группах животных титры антител не превышали 1:25 в РА, 1:10 в РСК и 1:20 в РНГА, тогда как в контрольных группах титры антител составляли в среднем 1:100 в РА, более чем 1:40 в РСК и 1:320 в РНГА. Эти данные показывают, что иммунизация морских свинок БЦВ по сравнению с живой вакциной из штамма 19 вызывает значительно сниженный уровень антителообразования и индуцирует сравнимый протективный эффект.

Таким образом, из примеров 2-5 следует, что БЦВ, приготовленная простым методом соединения белковой части водорастворимого антигена бруцелл вакционного штамма 19 с биологически инертным целлюлозным носителем, индуцирует выраженную реакцию клеточного иммунитета, но слабое антителообразование, и стимулирует развитие протективного иммунитета, напряженность которого возрастает со временем.

Использование: биотехнология, вакцина, профилактика бруцеллеза. Сущность изобретения: вакцину получают путем конъюгации белковых антигенов, выделенных из вакцинного штамма Br.abortus 19 с целлюлозной матрицей в присутствии треххлористого хрома. Изобретение позволяет получить при биологической безопасности производства вакцину против бруцеллеза, создающую длительный протективный иммунитет. 4 табл.

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ БРУЦЕЛЛЕЗА, включающий культивирование бруцелл с последующим выделением антигена и его конъюгацией с носителем, отличающийся тем, что для культивирования используют штамм Brucella abortus 19, антиген получают водной экстракцией, в качестве носителя используют целлюлозную матрицу, а конъюгацию антигена с носителем проводят при их соотношении 1 : 10 (по массе) в присутствии 25 мМ раствора треххлористого хрома.