ВАКЦИНА ПРОТИВ САЛЬМОНЕЛЛЕЗА СВИНЕЙ Российский патент 2005 года по МПК A61K39/112 C12N1/20 A61P43/00 

Изобретение относится к ветеринарной биотехнологии, в частности к средствам специфической профилактики сальмонеллеза свиней.

Salmonella choleraesuis является широко распространенным возбудителем сальмонеллеза животных различных видов и в первую очередь свиней, а также одним из возбудителей пищевых токсикоинфекций человека.

Ущерб, наносимый Salmonella choleraesuis, обусловлен высокой смертностью поросят, широко распространенным носительством у взрослого поголовья, затратами на противоэпизоотические и лечебные мероприятия. Сложность борьбы с сальмонеллезом определяется быстрой адаптацией возбудителя как к антибиотикам, так и другим химиотерапевтическим препаратам. В этой связи на первое место в борьбе с сальмонеллезом выступает вакцинопрофилактика с применением вакцин из живых аттенуированных штаммов.

Известна вакцина против сальмонеллеза свиней из аттенуированного штамма Salmonella choleraesuis TS-177, который представляет собой "дикий" мутант, не имеющий генетических маркеров, кроме пониженной вирулентности [1].

Известна также вакцина против сальмонеллеза свиней из супрессорного ревертанта Salmonella choleraesuis ВГНКИ №9 [2]. Штамм Salmonella choleraesuis ВГНКИ №9 отличается от эпизоотических штаммов высокой частотой (до 50%) выделения стрептомицинзависимых мутантов, вырастающих на МПА с содержанием стрептомицина 300 мкг/см³, большая часть из которых остается вирулентной. Поэтому дифференцировать вакцинный штамм от эпизоотических весьма сложно из-за необходимости изучать большое количество мутантных клонов. Кроме того, штамм Salmonella choleraesuis ВГНКИ №9 получен в результате мутаций, которые замедлили скорость его размножения почти в два раза по сравнению с исходным штаммом. Это существенно увеличивает затраты при производстве вакцины на его основе.

Задача изобретения - создание вакцины против сальмонеллеза свиней на основе генетически маркированного аттенуированного штамма Salmonella choleraesuis, обладающего высокой скоростью роста, более выраженной иммуногенностью, низкой остаточной вирулентностью и стабильно сохраняющего эти свойства.

Поставленная задача решается получением вакцины, содержащей суспензию живых микробных клеток аттенуированного штамма Salmonella choleraesuis ВГНКИ SC 230-ДЕП, сахарозу, желатин и дистиллированную воду при следующем соотношении компонентов, об%:

Суспензия штамма Salmonella choleraesuis SC 230-ДЕП

с концентрацией 100-120 млрд. клеток в 1 см³ - 42,0-55,0

Сахароза - 5,0-7,5

Желатин - 1,5-2,0

Вода дистиллированная - остальное

Полученная вакцина в отличие от известных более эффективна в качестве средства специфической профилактики сальмонеллеза свиней, более экономична в производстве, имеет стабильные генетические маркеры.

Аттенуированный штамм Salmonella choleraesuis ВГНКИ SC 230-ДЕП получен методом инсерционного мутагенеза из вирулентного штамма Salmonella choleraesuis ВГНКИ №95.

Штамм Salmonella choleraesuis SC 230-ДЕП депонирован в коллекции микроорганизмов Всероссийского государственного научно-исследовательского института контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов и имеет регистрационный номер SC 230-ДЕП.

Штамм Salmonella choleraesuis SC 230-ДЕП характеризуется следующими признаками.

Морфология. Бактериальные клетки представляют собой мелкие грамотрицательные палочки длиной 1,0-1,5 мкм и шириной 0,1-0,3 мкм, подвижные с перитрихиально расположенными жгутиками, спор и капсул не образуют.

Культуральные признаки. Клетки штамма хорошо растут на простых питательных средах. При росте на плотной питательной среде (МПА, среда Хоттингера, питательный агар “Дифко”) при температуре 37°С за 20-24 ч вырастают колонии диаметром 1,0-1,5 мм в S-форме: прозрачные, круглые, гладкие, выпуклые. При росте в жидких питательных средах наблюдается равномерное помутнение среды, характерное для бактерий “гладкого” типа.

По характеру роста на питательных средах штамм не отличается от эпизоотических штаммов Salmonella choleraesuis.

Ферментативные свойства. Сбраживает с образованием кислоты и газа глюкозу, мальтозу, галактозу, маннит, сорбит, ксилозу, рамнозу, дульцит, цитрат натрия, глицерин; не сбраживает сахарозу, лактозу, арабинозу, инозит, не образует индол, не свертывает и не пептонизирует молоко, образует сероводород.

Антигенная структура - типичная для сальмонелл серовара Salmonella choleraesuis. Агглютинируется сальмонеллезными монорецепторными "O"-сыворотками: 6, 7 и "Н"-сыворотками специфической фазы - "с" и неспецифической фазы - 1, 5.

Генетические маркеры. Штамм устойчив к рифампицину, стрептомицину и триметоприму. Маркеры устойчивости стабильно сохраняются в условиях периодического культивирования штамма в жидкой среде (10 последовательных пересевов) и после трех пассажей через белых мышей.

Вирулентность. 50%-ная летальная доза (LD₅₀) для белых мышей массой 18-20 г составляет 10 млн микробных клеток (при внутрибрюшинном заражении).

Иммуногенность. Однократная подкожная иммунизация белых мышей массой 16-18 г живой культурой штамма Salmonella choleraesuis SC 230-ДЕП (10³-10⁶ микробных клеток) профилактирует развитие инфекционного процесса после внутрибрюшинного заражения (через 21 день после иммунизации) культурой вирулентного штамма серовара Salmonella choleraesuis ВГНКИ №95 в дозе 100 LD₅₀. Выживает от 80 до 100% иммунизированных мышей при 100%-ной гибели неиммунизированных животных. ЕД₅₀=1,4×10³ микробных клеток.

Морфологические изменения в органах иммунизированных животных характеризуются диффузионной и очаговой пролиферацией лимфоидных элементов (увеличение региональных и мезентериальных лимфоузлов) без некробиотических процессов в паренхиматозных органах. Бактерии штамма Salmonella choleraesuis SC 230-ДЕП сохраняются в организме мышей в течение 15-22 дней.

Основные свойства штамма Salmonella choleraesuis SC 230-ДЕП и вакцины, полученной на его основе, иллюстрируются следующими примерами.

Пример 1. Для получения аттенуированного штамма Salmonella choleraesuis используют вирулентный штамм Salmonella choleraesuis ВГНКИ №95. Штамм предварительно маркируют мутацией rif, обеспечивающей устойчивость к рифампицину. Селекцию Rif^r - мутантов проводят на плотной питательной среде, содержащей 100 мкг/см³ рифампицина, высевая 2×10⁹ микробных клеток культуры штамма Salmonella choleraesuis ВГНКИ №95.

Для проведения инсерционного мутагенеза используют транспозон Тn7, входящий в состав векторной плазмады с температурочувствительной репликацией ДНК pVD3::Tn7 (Тc Ар Km Sm Tp). Передачу плазмиды в реципиентный штамм Salmonella choleraesuis ВГНКИ №95-Rif осуществляют в конъюгационном скрещивании: E.coli JC 1553 (pVD3::Tn7) x Salmonella choleraesuis 95-Rif^r. Отбирают трансконъюганты Salmonella choleraesuis 95-Rif (pVD3::Tn7) с фенотипом Rif^r (определяется rif-мутацией штамма) Tc^r Ap^r Km^r (маркеры плазмиды pVD3) Tp^r Sm^r (маркеры транспозона Tn7) [3].

Для отбора инсерционных мутантов бактерии Salmonella choleraesuis 95-Rif (pVD3::Tn7), выращенные при температуре 31°С в L-бульоне, высевают на плотную питательную среду, содержащую стрептомицин (40 мкг/мл) или триметоприм (50 мкг/мл), и инкубируют при температуре 43°С. У выросших клонов проверяют наличие неселектируемых маркеров векторной плазмиды (Тc Km Ар) и отбирают варианты, содержащие только маркеры Tn7 (Sm Tp), то есть клоны с инсерциями Tn7. Оценивают вирулентность инсерционных мутантов в опытах по внутрибрюшинному заражению белых мышей и отбирают штаммы с пониженной вирулентностью. Штамм Salmonella choleraesuis SC 230-ДЕП выявлен при анализе 60 инсерционных мутантов вирулентного штамма Salmonella choleraesuis ВГНКИ №95.

Пример 2. Изучение стабильности генетических маркеров аттенуированного штамма Salmonella choleraesuis SC 230-ДЕП.

Исследуют сохранение маркеров устойчивости к стрептомицину (Sm) и триметоприму (Tp) транспозона Tn7, инсерция которого привела к аттенуации штамма SC 230, в условиях периодического культивирования этого штамма в L-бульоне (LB) и в тех же условиях с последующим заражением белых мышей и анализом выделенной из инфицированного организма культуры. В обоих случаях культуру штамма после завершения эксперимента клонируют на плотной питательной среде и определяют наличие маркеров Sm^r и Тр^r не менее чем у 50 клонов. Результаты экспериментов представлены в таблице 1.

Пример 3. Определение остаточной вирулентности аттенуированного штамма.

Белых мышей массой 18-20 г заражают внутрибрюшинно суспензией агаровой культуры Salmonella choleraesuis SC 230-ДЕП; заражающие дозы 10⁵, 10⁶, 10⁷, 10⁸ микробных клеток. Контрольную группу животных заражают культурой вирулентного штамма Salmonella choleraesuis ВГНКИ №95. За животными наблюдают 21 сутки. В этих условиях эксперимента LD₅₀ Salmonella choleraesuis SC 230-ДЕП, рассчитанная по методу Кербера, колеблется от 5×10⁶ до 5×10⁷ клеток, LD₅₀ штамма Salmonella choleraesuis ВГНКИ №95 - 10-100 клеток. Таким образом, остаточная вирулентность штамма Salmonella choleraesuis SC 230-ДЕП для белых мышей в 100000 раз ниже по сравнению с вирулентностью исходного штамма.

Пример 4. Протективные свойства аттенуированного штамма Salmonella choleraesuis SC 230-ДЕП определяют в экспериментах на белых мышах. Белым мышам массой 16-18 г подкожно вводят суспензию аттенуированного штамма в дозе 1×10⁴ микробных клеток. Через 20 дней иммунизированных и неиммунизированных животных заражают 100 LD₅₀ вирулентного штамма Salmonella choleraesuis ВГНКИ №95.

Сравнительные результаты трех опытов по определению протективных свойств аттенуированного штамма Salmonella choleraesuis SC 230-ДЕП представлены в таблице 2.

Пример 5. Способность аттенуированного штамма Salmonella choleraesuis SC 230-ДЕП профилактировать сальмонеллез свиней определяют на поросятах. Поросятам 20-25-дневного возраста внутримышечно вводят суспензию аттенуированного штамма в дозе 5×10⁸ микробных клеток. Через 21 сутки иммунизированных и неиммунизированных животных внутрибрюшинно заражают культурой вирулентного штамма Salmonella choleraesuis ВГНКИ №95 в дозе 4×10¹⁰ микробных клеток. Результаты двух опытов представлены в таблице 3. Иммунизация поросят аттенуированным штаммом Salmonella choleraesuis SC 230-ДЕП предохраняет от гибели после заражения вирулентным штаммом 90% животных при 100%-ной гибели животных в контрольной группе.

Пример 6. Изготовление вакцины против сальмонеллеза из штамма Salmonella choleraesuis SC 230-ДЕП.

В реактор с бульоном Хоттингера (300 л) вносят матровую расплодку микробных клеток штамма из расчета 35 млн/см³. Центрифугируют при 15 тыс. об/мин в течение 60 минут. Бактериальную массу смешивают с желатино-сахарозовым стабилизатором в соотношении 1:2.

Вакцину расфасовывают в ампулы по 4 см³ и лиофилизируют.

Вакцина серии 1 имеет следующий состав, об %:

Суспензия штамма Salmonella choleraesuis SC 230-ДЕП

с концентрацией 100-120 млрд. клеток в 1 см³ - 55,0

Сахароза - 7,5

Желатин - 2,0

Вода дистиллированная - остальное

Вакцина серии 2 имеет следующий состав, об%:

Суспензия штамма Salmonella choleraesuis SC 230-ДЕП

с концентрацией 100-120 млрд. клеток в 1 см³ - 42,0

Сахароза - 5,0

Желатин - 1,5

Вода дистиллированная - остальное

Пример 7. Безвредность предложенной вакцины по величине переносимой дозы изучена на белых мышах, морских свинках и поросятах. Данные опытов суммированы в таблице 4.

Из данных, представленных в таблице 4, видно, что переносимая доза вакцины, не вызывающая гибели мышей, в 5×10⁵ и 1,0×10⁵ раз ниже минимальной смертельной дозы вирулентного штамма Salmonella choleraesuis ВГНКИ №95 соответственно при подкожном и пероральном заражении.

Пример 8. Способ профилактики сальмонеллеза свиней включает двукратное введение вакцины поросятам в возрасте 10-12 и 18-20 дней в дозе 500 млн микробных клеток.

Проведено испытание вакцин из штамма Salmonella choleraesuis SC 230-ДЕП и Salmonella choleraesuis ВГНКИ №9 для профилактики сальмонеллеза свиней.

Из данных, представленных в таблице 5, следует, что заболеваемость поросят, иммунизированных предложенной вакциной из штамма Salmonella choleraesuis SC 230-ДЕП, в 2 раза ниже, а сохранность на 8,6% выше по сравнению с теми же показателями для группы поросят, иммунизированных вакциной из штамма Salmonella choleraesuis ВГНКИ №9.

Источники информации

1. Ветеринарное законодательство. T.1.- M.: Колос, 1973.- С.554.

2. А.с. СССР №1577116, 1988 г.

3. Воложанцев Н.В., Светоч Э.А., Борзилов А.И. и др. Получение вакцинных штаммов сальмонелл с помощью инсерционного мутагенеза //Ветеринария - 1997, №9, с.20-24.

Таблица 1
Стабильность наследования генетических маркеров в аттенуированном штамме Salmonella choleraesuis SC 230-ДЕПУсловия культивирования% клонов, содержащих маркерАгглютинация сывороткой O7SmTр 10 последовательных пересевов в LB100100+10 пересевов в LB+3-кратный пассаж через белых мышей100100+

 
 
Таблица 2
Протективные свойства штамма Salmonella choleraesuis SC 230-ДЕП в экспериментах на мышахГруппа мышейОпыт №Количество мышей в опытеРезультаты зараженияпалиживыИммунизированные120119320416520020Итого 60555Контрольные220200420200620200Итого 60600

Таблица 3
Протективные свойства штамма Salmonella choleraesuis SC 230-ДЕП в экспериментах на поросятахГруппа поросятОпыт №Количество поросят в опытеРезультаты зараженияпалиживыИммунизированные15143505Итого 1019Контрольные25504550Итого 10100

Таблица 4
Безвредность вакцины для лабораторных животных и поросятЖивотныеСпособ введения вакциныПереносимая доза (к-во микр. кл. вакцинного штамма)Минимальная смертельная доза вирулентного штамма (к-во микр. кл.)Белые мыши (масса 16-18 г)Подкожно1,0×10⁷20Перорально1,0×10¹⁰1,5×10⁵Морские свинки (масса 300-350г) Поросята (12-15 дневные)Подкожно2,0×10¹⁰1,0×10⁹Перорально1,0×10¹¹1,0×10¹⁰

Таблица 5
Эффективность живых вакцин против сальмонеллеза свиней при применении предложенного способа профилактики сальмонеллеза свинейВид вакциныВзято в опыт головЗаболело голов (%)Пало голов (%)Сохранность, %Вакцина против сальмонеллеза свиней из штамма Salmonella choleraesuis SC 230-ДЕП67031(4,6)19(2,8)92,5Сухая живая вакцина из штамма Salmonella choleraesuis №981077(9,5)53(6,5)83,9

Изобретение относится к ветеринарии. Вакцина против сальмонеллеза свиней содержит суспензию клеток аттенуированного вакцинного штамма Salmonella choleraesuis ВГНКИ SC 230-ДЕП при следующем соотношении компонентов, об.%: Суспензия штамма Salmonella choleraesuis ВГНКИ SC 230-ДЕП с концентрацией 100-120 млрд. клеток в см³ 42,0-55,0; сахароза 5,0-7,5; желатин 1,5-2,0; вода дистиллированная - остальное. Заболеваемость поросят, иммунизированных вакциной, в 2 раза ниже, а сохранность - на 8,6% выше по сравнению с теми же показателями для поросят, иммунизированных известной вакциной из штамма Salmonella choleraesuis ВГНКИ №9. Вакцина более экономична в производстве и имеет стабильные генетические маркеры. 5 табл.

Вакцина против сальмонеллеза свиней, содержащая суспензию клеток вакцинного штамма, сахарозу, желатин и дистиллированную воду, отличающаяся тем, что в качестве вакцинного штамма она содержит аттенуированный штамм Salmonella choleraesuis ВГНКИ SC 230-ДЕП при следующем соотношении компонентов, об.%:

Суспензия штамма Salmonella choleraesuis ВГНКИ SC 230-ДЕП с концентрацией 100-120 млрд.клеток в 1 см³ 42,0-55,0

Сахароза 5,0-7,5

Желатин 1,5-2,0

Вода дистиллированная Остальное