СПОСОБ ПРОИЗВОДСТВА 5'-ИНОЗИНОВОй КИСЛОТЫ Советский патент 1969 года по МПК C12P19/32 

Известеи способ -получения б-инозйновой кислоты путем выращивания микроорганизмов, нродуцирующих ее составные части - гипоксантин и 0-рибозу-5-фосфорную кислоту «а нитательной среде, содержащей источник углевода, необходимые минеральные соли и стимуляторы роста с последующим смешиванием этих составных частей и .выделеиием 5-инозино1ВОй кислоты из полученной смешанной культуральной жидкости одилм из известных способов, например при номощи ионообменных смол.

Предлагаемый способ позволяет увеличить выход б-инозиновой кислоты.

Для этого в качестве .продуцентов используют штамм Brevibacterium ammoniagenes № 7209-1 АТСС №. 15454 и АТСС № 15187, а в качестве продуцента 0-рибозы-5-фос(|)ор.ной кислоты - Brevibacterium ammoniagenes АТСС № 6872, обладающий активностью (нуклеотид лирофосфорилазы.

Способ -получения 5-инозиновой кислоты заключается IB том, что микроорганизм Brevibacterium ammoniagenes № 7209-1 (АТСС JVb 15454 или Brevibacterium ammoniagenes АТСС № 15187) сначала выращивают в водной (Питательной среде, содержащей источники углевода, например глюкозу, амилодекстрин, отходы мелассы; источники азота, например, мочевину, аммиак или аммиачные соли.

источники фосфора, калия, например двухосновный фосфат кальция, одноосновный фосфат кальция, сульфат магния, сульфат калил, хлорид натрия и хлорид кальция, а также

стимуляторы роста, например дрожнсевой экстракт, казеин, гидролизат соевого жмыха, лептой, биотин, аденин.

Культивирование происходит в аэробных условиях при температуре 30°С в течение 16-

24 час. Затем выращенные клетки пересеивают в свежую питательную среду вышеописанного состава для накопления гипоксантина.

Культивирование производят в условиях

аэрации при темнературе 28-40°С, рН среды 6,0-8,0 в течение 2-4 дней. Значение рМ среды устанавливают с помощью мочевины или аммиака. Ферментацию проводят до тех нор, иока не накопится 3-8 мг гипоксантнна

на 1 мл среды.

Одновременно выращивают микроорганизм Brevibacterium ammoniagenes АТСС N° 6872, способный продуцировать 0-рибозу-5-фосфорную кислоту, обладающий активностью нуклеотид пирофосфорилазы, IB две стадии, на такой же питательной среде, при тех же условиях.

Затем культуральную жидкость, содфжащую гипоксантия, .при перемешивании смешивают с культуральной жидкостью, содержаш,ей нуклеотид иирофосфо-рилазы и О-рибозу5-фосфорную кислоту в соотношепии от 1 : 1 до 2:1, целесообразно 1 : 1, в результате чего гипоксантин .вступает в реакцию с D-рибозой-5-фосфо:рной кислотой в присутствии ферментов, при это,м образуется 5-инозиновая кислота. Для стимулирования образования последней в полученную смесь можно добавлять различйые сахариды. Процесс длится в течение 24--36 час.

После максимального накопления кислоты клетки удаляют одним из известных способов, например центрифугированием, а 5-инозиновую кислоту Получают из центрифугата путем пропуска его через ионообменную смолу. Пример 1.

Штамм Brevibacterium ammoniagenes 7209-1 (АТСС № 15454) .вырашивают на питательной среде, содержащей, %:

глюкозы3

дрожжевого экстракта2

пептона1

хлорида натрия0,25

Среду стерилизуют при температуре 120°С в течение 15 мин.

Культи вир 01ва.ние проводят в течение 24 час при температуре 30°С и постожнном встряхивании. Полученную маточную культуру в количестве 300 мл пересеивают в стерильную питательную среду, содержащую, %:

глюкозы10

дрожлсевого экстракта0,5

двухосновного фосфата

.калия0,4

одноосновного фосфата

-калия0,4

сульфата магния0,4

хлорида кальция0,012

В течение 3 дней с помощью а ммиачной воды рП среды Д01водят до 7,0. В питательной среде образуется 4,1 мг/мл гипоксактина.

Одно1времен1но выращивают микроорганизм Brevibacterium ammoniagenes АТСС Л 6872 в течение 24 час щи температуре 30°С и постоянном встряХИвании на стерильной питательной среде, содержащей, %:

глюкозы3

дрожжевого экстракта2

пентона1

хлорида натрия0,25

Затем толученную маточную культуру в количестве 300 Mji пересеивают .в 3 л свежей стерильной питательной среды, содержащей, %:

глюкозы8

дрожжевого экстракта0,4

двухосновного фосфата

калия0,4

Выращивание проводят в течение 3 суток при перемешивании, насыщении кислородом и значении рН среды 7,0.

Культуральные жидкости, цолученные на второй стадии выращивания Brevibacterium ammoniagenes 7209-1 (АТСС № 15454 и „NO 6872) по 1,5 л каждой смешивают и добавляют глюкозу в таком количестве, чтобы в смеси ее было 5%.

Ферментацию 5-инозиновой кислоты проводят в течение 3 суток, поддерживают рП среды 7,0 посредством аммиачной воды. Затем смесь подогревают для коагуляции клеток и отделяют их центрифугированием. Центрифугат пропускают через ионообменную смолу Диа-ион SKLA, после чего ионообменную смолу промьивают ВОДой.

Полученный раствор 5-инозиновой кислоты с рН, равным 2, вновь .пропускают через ионообменную смолу Диа-ион 2AIA.

Таким образо.м получают 240 мл раствора инозиновой кислоты, из которого выделяют 0,5 N соляной кислотой 42,8 г кристаллического натрия 5-инозината.

Для получения 5-инозиновой кислоты используют штаммы Brevibacterium ammoniagenes № 7209-1 АТСС 15454 и АТСС № 15187, продуцирующие г.ипоксантин и АТСС № 6872, продуцирующий О-рибозу-5-фосфорную кислоту, обладающий активностью нуклеотид пирофосфорилазы.

Штаммы Brevibacterium ammoniagenes 7209-1 АТСС jYo 15454 и АТСС № 6872 характеризуются следующими морфологическими и культуральным.и нризнаками.

Оба штамма выделены из детского кала.

Морфология. Палочки с закругленными концами, размером 0,8 X 1,4 X 1,7 мк, одиночные, без .капсул, непо.движпые, грамположительные.

Минеральная среда. Агар. Колонии круглые, плоские гладкие, сер:ого цвета. Иногда встречается слабо-желтый хромогенез.

Па косом агаре наблюдается умеренный рост. Колонии гладкие, плоские, светонепроницаемые, блестящие, консистенция сливочного масла, аморфные, без запаха.

Бульон: умеренное помутнение вблизи поверхности, пушистый осадок. Желатин ие разжижает.

Лакмусовое молоко слабо щелочное.

Индол не образует.

Отношение к нитратам. Переводит в нитрИ; ты.

Мочевину сбралсавает с образованием аммиака.

Сыворотку крови не слсижает.

Аэроб, факультативный анаэроб.

Оптимальная температура раз вития 30°С, при 55°С ногибает за 10 мин.

Олтимальный рИ от 7,0 до 8,5.

Предмет изобретения

Способ получения б-инозиновой кислоты путем выращивания микроорганизмов, продуцирующих ее ооставные части - пипоксантин и О-рибозу-5-фосфорную кислоту на питательной среде, Содержащей источник углевода, необходимые минеральные соли и стимуляторы роста с .последующим смещиванием этих составных частей и выделением 5-инозиновой кислоты из полученной смешанной

культуральной жидкости одним из известных способов, например при помощи ионообменных смол, отличающийся тем, что, с целью увеличения выхода 5-иноз«новой кислоты, в качестве продуцентов гипоксантина используют штаммы Brevibacterium ammoniagenes № 7209-1, АТСС № 15454 или АТСС №. 15187, а в качестве продуцента В-рибозы-5-фосфорной кислоты - Brevibacterium ammoniagenes АТСС № 6872, обладающего активностью нуклеотид Пирофосфорилазы.